Summary
هذا الفيديو يظهر إجراء لعزل protoplasts سليمة من أنسجة لمدة 14 يوما من العمر شتلة من Arabidopsis. بالنظر إلى أن protoplasts معزولة لا تزال سليمة على الأقل 96h ومعزولة من الشتلات بدلا من شهر واحد من العمر محطات ناضجة ، وهذا الإجراء يعجل المقايسات التي تتطلب protoplasts سليمة.
Abstract
Protoplasts هي الخلايا النباتية التي كانت جدران الزنزانة لازالة إنزيمي. وكانت أول من العزلة protoplasts من الأنسجة النباتية المختلفة أكثر من 40 عاما
Protocol
الجزء 1. إعداد المتوسطة صلبة لنمو النباتات.
نحن عادة ما تتركز على النباتات الثقافة المتوسطة (MS) وسكوغ Murasige تستكمل مع السكروز 1 ٪ و 0.7 ٪ أجار. فهو يحتوي على كل العناصر الضرورية للحفاظ على النباتات السليمة.
لإعداد MS 1L من وسائل الاعلام الرقم الهيدروجيني 5.7
- إضافة 2،15 غرام من مسحوق MS في 800 مليلتر من الماء في زجاجة 1.5 2.0L autoclavable.
- وضع شريط التحريك في زجاجة ومسحوق يذوب MS خلال إثارة المتوسطة على طبق من التحريك.
- مع التحريك ، إضافة ، قطرة قطرة ، 1N KOH لضبط درجة الحموضة من المتوسط إلى 5.7 MS.
- إضافة 10 غرام من السكروز ، والحفاظ على التحريك.
- إضافة 7 غرام من آغار *.
- ضبط الحجم النهائي للمتوسط على استعداد ل1000 مل وتعقيم التعقيم بواسطة.*
- مكان تعقيمها المتوسطة على طبق من التحريك وتبريده مع التحريك ، بحيث آغار ولن يعجل في الجزء السفلي من القمقم. يبرد المتوسط إلى 60 درجة مئوية. ~ *
- صب 100 ملم لوحات بتري. لوحات في الحفاظ على 4 درجات مئوية.
* نصيحة 1 : لا تحاول حل آغار. فإنه solubilize خلال التعقيم.
* نصيحة 2 : حافظ على شريط التحريك في زجاجة خلال التعقيم ، ستحتاج في وقت لاحق.
* نصيحة 3 : إذا كنت يمكن أن تبقي يديك على الزجاجة تعقيمها لمدة 10 ثانية ، فهذا يعني أن متوسط هدأت بما فيه الكفاية ، ويمكنك البدء في صب لوحات.
الجزء 2. المواد النباتية وشروط النمو.
- تعقيم البذور من thaliana Arabidopsis
- مكان 100 ملغ من البذور في أنابيب microcentrifuge إيبندورف وإضافة 1 مل من الايثانول 70 ٪. مزيج جيد واحتضان لمدة 2 دقيقة. تدور بذور أسفل ، ونضح طاف.
- إضافة 1 مل من محلول التبييض التي تحتوي على 1.8 ٪ * 0.1 ٪ توين - 20. المزيج لمدة 10 دقيقة. تدور باستمرار البذور ونضح محلول التبييض.
- هذه الخطوة لابد من القيام به في تدفق الصفحي هود. إضافة 1 مل من الماء المعقم على البذور وتخلط جيدا. تدور باستمرار البذور ، ونضح الماء. كرر هذه الخطوة 5 مرات.
- انتشار البذور على استعداد للفي الخطوة 1 لوحات (100 بذور / لوحة).
- لوحات للحفاظ على المصنف 24-48 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة الطبقية.
- تنمو النباتات لمدة 14 يوما في غرفة النمو مع 8 ح ح light/16 الإضاءة الداكنة (على كثافة تدفق الفوتون الضوئي من 250 μmol ق م -2 -1) في 23 / 19 ° C درجة حرارة النظام الضوء / الظلام والنسبية 75 ٪ الرطوبة.
* نصيحة 1 : يتم متابعة حل عن طريق تخفيف بليتش a كلوروكس المنزلية ، والتي تحتوي على 6 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم واضاف توين - 20 إلى تركيز النهائي من 0.1 ٪.
الجزء 3. عزلة protoplasts من الشتلات Arabidopsis.
- 2 غرام من شريحة لمدة 14 يوما من العمر الشتلات بشفرة حلاقة جديدة في 15 مل من محلول تعقيم فلتر TVL. نحن ختم المواد النباتية في أطباق بتري معقمة المتاح.
- نقل الأنسجة المقطعة في الدورق 200 مل ، أضف 20 مل من محلول أنزيم فلتر تعقيم ، دوامة الدورق السماح الأنسجة الاختلاط مع محلول أنزيم ، مع تغطية parafilm ورقائق الألومنيوم.
- اهتزاز الأنسجة النباتية في 35 دورة في الدقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ل16-18 ساعة.
- جمع protoplasts صدر في 50 مل أنبوب فالكون بواسطة النخل من خلال 8 طبقات من القماش والجبن ، وقبل الرطب في W5 الحل.
- protoplasts غربال من مرة واحدة أكثر الجبن القماش بواسطة غسل القماش مع 15 مل من محلول W5.
- بعناية protoplasts تراكب مع 10 مل من محلول W5 ، لا تعكر صفو التدرج السكر ، لمدة 7 دقائق بنسبة 100 غرام الطرد المركزي
- جمع 10 مل من protoplasts في واجهة من محلول أنزيم W5 والحل (الشكل 1B) ونقل إلى 50 عضوا جديدا أنبوب فالكون مل.
- إضافة 15 مل W5 الحلول الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 60 ز إزالة طاف.
- غسل protoplasts خالية من محلول أنزيم عن طريق إعادة التعليق في protoplasts 15ml W5 من أجهزة الطرد المركزي ، محلول لل5min عند 60 ز
- إزالة ، resuspend طاف protoplasts مكعبات في الحل W5 1 - 3ml.
- تقييم العائد الجبلة المجردة من قبل خلية العد مع عدادة الكريات.
الجزء 4. الكواشف :
TVL : 0.3 M السوربيتول و 50 ملي CaCL 2 - تعقيم وتصفية المحل في -20 درجة مئوية.
الحل انزيم : 0.5 M السكروز ، 10 ملي MES - KOH [الرقم الهيدروجيني 5،7] ، 20 ملي CaCl 2 ، 40 ملم بوكل ، سلولاز 1 ٪ (Onozuka R - 10) ، Macerozyme 1 ٪ (R10). فلتر تعقيم واستخدام حديثا.
W5 الحل : 0.1 ٪ (W / V) الجلوكوز ، 0.08 ٪ (W / V) بوكل ، 0.9 ٪ (W / V) كلوريد الصوديوم ، 1.84 ٪ (W / V) CaCl 2 ، 2 مم MES - KOH الرقم الهيدروجيني 5.7. فلتر تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
الجزء 5 : نتائج الممثل :
به الظروف Arabidopsis الثقافة وصفها في أجزاء 1 و 2 يجعل الشتلات صحية ، ومناسبة لعزل protoplasts (الشكل 1A). الجبلة المجردة التي يتم تنقيتها السكروز كثافة غراديالطرد المركزي والأنف والحنجرة وجمعها في واجهة W5 والحلول انزيم (الشكل 1B). الجبلة المجردة تستخدم إجراء العزل وصفها في الجزء 3 ونحن الحصاد عادة 05-10 أكتوبر 6 من protoplasts سليمة (الشكل 1C) من غرام واحد من شتلات جديدة.
الشكل 1. عزلة protoplasts من الشتلات Arabidopsis. وكان تم جمعها من الأنسجة لمدة 14 يوما من العمر شتلة من Arabidopsis وتحويلها إلى protoplasts بواسطة إجراء تعديل من (تشن وHalkier ، 2000). باء ، المنقى Protoplasts بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة السكروز وجمعها في واجهة من والحل انزيم W5 uffer (السهام البيضاء). C ، برايت الحقل المجهري لprotoplasts. جمعت Microphotographs باستخدام كاميرا CCD تبريد ربطه مع Axioscope زايس 2 زائد المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لضمان عالية الغلة من الجبلة المجردة سليمة من المهم جدا البدء مع النباتات صحية. استخدام فلتر تعقيم حلول لعزل protoplasts. تذكر أن protoplasts هشة. لذلك ، عندما كنت التعامل مع protoplasts ، لا يختلطان الماصة أو دوامة منهم منذ ذلك بقوة ستحد منها. بدلا من ذلك ، مزيج protoplasts عن طريق تناوب ببطء أو تسجيل أنبوب الطرد المركزي. العائد الداخلي protoplasts سليمة صفها التي هي قابلة للحياة ما لا يقل عن 96 ساعة. ولذلك ، يمكن استخدام protoplasts لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، مثل توطين التحت خلوية من البروتينات ، والعزلة وتحليلات للعضيات سليمة وهادفة تعطيل الجينات التي تدخل الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط (رني) ، إلخ 3-5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد قدم براءة اختراع مؤقتة واصفا هذا الإجراء لاستخدامها في التحليلات الفنية للجينات النباتية مع مركز كورنيل للمؤسسات التكنولوجيا وتسويقها (CCTEC) ، حزيران 2008. المفكرة لا 50341/015001 : Vatamaniuk ، موافق ، وتشاي ، Z. التحليلات الفنية للأسلوب السريع للجينات النباتية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل محطة جامعة كورنيل التجربة الزراعية (CUAES) NYC - 125433 هاتش غرانت وكورنيل بدء المنحة لOKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
