En In Vitro Hudirritationstest (SIT) med hjälp av EpiDerm Rekonstruerad human epidermal (RHE) Modell

Summary

I denna video visar vi de EpiDerm testa Hudirritation (EpiDerm SIT) utvecklat och validerat för

Abstract

Den EpiDerm Hudirritationstest (EpiDerm SIT) har utvecklats

Protocol

I. Tissue conditioning - Dag 0

1. Vid mottagandet av EpiDerm EPI-200-SIT kit, kolla alla kit komponenter för integritet (för kit detaljer se tabell av särskilda reagenser och utrustning).
2. För varje tre EpiDerm vävnader, förbereda en steril 6-brunnar förfylld med 0,9 ml analyssubstratet.
3. Under sterila förhållanden, öppna plastpåsen som innehåller 24-brunnar innehåller EpiDerm vävnader och ta bort steril gasbinda.
4. Använd steril tång för att ta bort varje insats innehåller EpiDerm vävnad och placera in i den tomma 24-brunnar. Under detta steg, ta bort alla kvarvarande frakt agaros som fäster på utsidan av insatsen genom att försiktigt läskpapper på sterila filterpapper.
5. Inom de närmaste 5 minuter, visuellt inspektera vävnader. Använd inte defekta vävnader eller vävnader som är helt täckta med vätska.
6. Använd en steril bomull spets kompress försiktigt torra ytan av vävnader. Försök att inte vidröra vävnaden direkt - kapillär effekter är tillräckliga för att avlägsna fukt från vävnaden ytan.
7. Efter torkning vävnadsytan, överföring tre vävnader till översta raden i 6-brunnars plattor förfylld med 0,9 mL analyssubstratet. Släpp eventuella luftbubblor fångas under insatser.
8. Placera 6-brunnars plattor som innehåller sättas i inkubator för ett 60 ± 5 minuter före inkubering vid 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO _2, 95% RH (relativ fuktighet).
9. I slutet av 60 ± 5 minuter före inkubationstid, överföra insatser från övre brunnar i den nedre brunnar på 6-brunnar. Placera plattorna tillbaka in i inkubatorn (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO _2, 95% RH) för en övernattning före inkubation (18 ± 3 tim).
10. Placera resten av analyssubstratet i kylskåp (5 ± 3 ° C). Efter den natten före inkubation kan testa kemikalier som appliceras på EpiDerm vävnader.

    Obs: före inkubation förfarande kan förkortas vid sen vävnad leverans (t.ex. om vävnader kommer på onsdag istället för tisdag).

II. Kemisk exponering - Dag 1

1. Förbered en 6-brunnar per test kemiska genom att fylla den övre raden endast med 0,9 ml per brunn analyssubstratet.
2. Ca 5 minuter innan den planerade exponering för kemikalier, ta bort 6-brunnars plattor som innehåller konditionerade vävnader från inkubatorn.
3. Utvärdera ytan av vävnader och ta bort eventuell fukt med steril bomull tips.
4. Etikett alla 6-brunnar lock med koderna provmaterialet eller namn.
5. Dos vävnaderna med testet kemikalier på 1 minut för att underlätta sköljning av testet kemikalier efter exponering. Håll plattorna med doseras vävnader i sterila huva, tills den sista vävnaden doseras.
6. För att testa flytande kemikalier, dosera 30 mikroliter av lösningen direkt ovanpå den vävnad och placera nylon mesh på vävnader ytan. Om det behövs, försiktigt placera mesh med glödlampan leds glaset pasteurpipett. Tryck inte på vävnaden ytan.
7. För att testa semisolids, använd en positiv förskjutning pipett att dosera 30 mikroliter direkt ovanpå vävnad. Om nödvändigt att sprida kemiska med pasteurpipett att täcka vävnaden ytan så mycket som möjligt.
8. För fasta material, strax före applicering av testämnet, fukta vävnaden ytan med 25 mikroliter sterilt DPBS. Detta kommer att förbättra kontakten mellan vävnaden ytan med testämnet. Fyll en 25 mg kalibrerad skarp tillämpning sked (eller något annat lämpligt verktyg) med cirka 25 mg finmalen provmaterial. Applicera den fasta testämnets till vävnaden ytan. Om det behövs, använd en glödlampa leds pasteurpipett att tömma sked helt. Skaka försiktigt insatser för att förbättra spridning av fast på ytan.
9. För ämnen med vaxartad konsistens, försök att bilda en platt "cookie som" stycke om 8 mm i diameter och lägg den ovanpå vävnad, som tidigare var fuktade med steril DPBS. För att förbättra kontakten mellan testämnet och vävnad, tynga "cookie" med ett rostfritt stål eller plast stöd.
10. Applicera DPBS som negativ kontroll och 5% SDS som positiv kontroll till kontroll vävnader.
11. Efter dosering den sista vävnaden, överföra alla plattorna under 35 ± 1 minuter till befuktas inkubatorn (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO _2, 95% RH).
12. Efter 35 ± 1 minut inkubation vid 37 ° C ta bort alla plattor från inkubatorn. Placera plattorna i sterila huva och vänta tills en period av 60 minuter kemisk exponering är klar för doseras first vävnad.
13. Därefter startar tvättningen med en insert per minut tidsintervall (försäke att den totala exponeringstiden för varje Insatsen är 60 minuter).
14. Använd en sprutflaska att skölja vävnader med sterila DPBS. Fyll i vävnaden in 15 gånger med hjälp av en konstant ström av DPBS och töm den (Obs!. För vävnader med en nylon mesh, tvätta vävnadsytan 5 gånger och ta bort nätet noga med spetsiga, vassa pincett Efteråt fortsätter med de återstående 10 tvättar).
15. Efter den 15: skölj med tvättflaskan helt dränka insatsen 3 gånger i 150 ml DPBS och skaka för att ta bort resten av testmaterialet.
16. Slutligen, skölj vävnaden in en gång från insidan och en gång från utsidan med sterila DPBS.
17. Ta bort eventuella överskott av DPBS från vävnaden genom att försiktigt skaka infoga och blotting det på den sterila läskpapper.
18. Överför utplånade vävnaden skär till den nya 6-brunnar tidigare förfylld med analyssubstratet. Alla dessa steg (14-18) måste göras inom 1 minut för varje insats.
19. Efter den sista vävnaden sköljs försiktigt torka ytan av varje vävnad med en steril bomull tippas pinnen.
20. Inkubera vävnaderna i inkubatorn för nästa 24 ± 2 timmar (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO _2, 95% RH).

    Notera: Varje analys tekniker bör inte testa mer än 6 testämnen inklusive de negativa och positiva kontroller i en enda test köra (SET), för att kunna följa protokollet som beskrivs nedan

III. Medium utbyte - Dag 2

1. Efter 24 ± 2 timmar efter inkubation, överföra sätts in i nedre delen av 6-brunnar, förfylld med 0,9 ml av media. Media från övre rader kan tas för analys av de ytterligare endpoints (cytokiner, kemokiner etc.). Analys av sekundära endpoints är valfritt.
2. Fortsätt med efter inkubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO _2, 95% RH) för ytterligare 18 ± 3 timmar.

IV. MTT livskraft analys - Dag 3

1. Märk två 24-brunnars plattor med den kemiska namn eller koder. En platta kommer att tjäna på mjukpapper inkubation med MTT och den andra för extraktionen.
2. Förbered MTT lösning genom upptining MTT koncentrat (5 mg / ml) och späda den med MTT spädningsvätskan. Slutlig koncentration av MTT lösning är 1 mg / ml.
3. Pipettera 300 mikroliter av MTT-lösning i varje brunn på 24 brunnar.
4. Ta bort 6-brunnars plattor från inkubatorn, blot botten av insatserna på ett läskpapper och överföra dem i 24-brunnar förfylld med MTT.
5. Placera 24-brunnar i inkubatorn (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO _2, 95% RH) och inkubera i 3 timmar ± 5 min. Strikt följa de 3 timmar ± 5 tiden minuter inkubation att undvika avvikelser mellan olika MTT avläsningar.
6. När MTT inkubation är avslutad använder en sugpump för att försiktigt aspirera MTT mediet från alla brunnar.
7. Fyll brunnarna med DPBS och aspirera på nytt. Upprepa denna sköljning två gånger till och se till att vävnader är torra efter den sista aspiration.
8. Efter tvättar överföra skär till en ny 24-brunnar. Sänk insatserna genom att försiktigt pipettera 2 ml extraktant (Isopropanol) i varje insats. Nivån kommer att stiga över den övre kanten av insatsen, vilket helt dränka vävnader.
9. Täta 24-brunnar (t.ex. med Parafilm eller använda tätning väska) för att hämma extraktant avdunstning. Utdrag MTT från vävnaderna i minst 2 timmar vid rumstemperatur under försiktig skakning på en tallrik skakapparat (~ 120 rpm). Övernattning utvinning utan att skaka kan också användas.
10. Efter utvinningen perioden är klar hål i skär med en injektionsnål eller lampa pärlstav pasteurpipett och låt extraktet att köra ner i brunnen som det införda togs.
11. Kasta punkteras in och pipettera lösningen i väl upp och ner tre gånger tills den är homogen.
12. För varje vävnad, överföring två 200 mikroliter alikvoter av den lila formazanförening lösningen i en 96-håls platta botten mikrotiterplattan. Överför dubbletter enligt den fasta plattan utformning ges i tabellen som medföljer denna video protokoll. För ämnen, använda isopropanol.
13. Läs optiska densitet (OD) MTT extrakt i en 96-brunnar spektrofotometer med en våglängd på 570 nm (540-580) utan en referens filter.
14. Skriv in resultaten i tabellen för automatisk beräkning av resultaten (figur 1).
15. Ett test kemikalie är märkt "irriterande" (R38 eller GHS kategori 2) Om procent vävnaden bärkraft bestäms av MTT-analysen är <50% i förhållande till den negativa kontrollen.
    

    Obs: MTT är giftig, så se till att använda skyddshandskar vid hantering. Skydda MTT och dess såningar från ljus, eftersom MTT är ljuskänsligt. Använd MTT lösning inom några timmar efter beredning, eftersom den försämrar med tiden.

V. analys kvalitetskontroller

• EpiDerm EPI-200-SIT-kit Acceptanskriterier:

  In vitro RHE modellerna bör ge konsekventa, högkvalitativa data över tiden, inte bara under valideringsprocessen ^(8). Rekommenderade riktlinjer för att säkerställa långsiktig analys reproducerbarhet och prestanda inkluderar "full karakterisering av celler eller vävnader, provtagning av varje parti ... för prestanda, och regelbunden användning av kontroller och riktmärke kemikalier för att ge försäkran om överensstämmelse analysens prestanda" ⁽⁹⁾ . Förutom kriterier analys acceptans nedan är varje produktion mycket EpiDerm kvalitetskontroll utprovats av tillverkaren mot en extra riktmärke kemisk (1% Triton X-100). Exponeringen tid som behövs för att minska vävnad livskraft till 50% (ET-50) för Triton X-100 bestäms är. För EpiDerm har årliga genomsnittliga ET-50 värden varierade från 5,9 timmar till 7,5 timmar. Det parti till parti CV för negativ kontroll vävnader (dvs. variationen i baslinjen lönsamheten) har i genomsnitt under 7,5% för varje år sedan 1996. Det ET50 värdet av varje framställt parti måste ligga inom två standardavvikelser av det historiska genomsnittet Triton X-100 ET50 grundades 1996 (dvs ET-50 = 6,7 timmar, lägre acceptansnivå gräns = 4.8h, övre acceptans gräns = 8.7h) i syfte att släppas för att användas av tillverkaren.

• EPI-200-SIT-analys Acceptans Kriterium 1: Negativ kontroll:

  Den absoluta OD av den negativa kontroll (NC) vävnader (som behandlas med sterilt DPBS) i MTT-testet är en indikator av vävnad livskraft som erhållits i laboratorium efter frakt och lagring förfaranden och på särskilda villkor för användning. Analysen uppfyller kriteriet för godkännande om medelvärdet OD ₅₇₀ av NC vävnader är ≥ 1,0 och ≤ 2,5.

• EPI-200-SIT-analys Acceptans Kriterium 2: Positiv kontroll

  En 5% SDS (i H ₂ O) Lösningen används som positiv kontroll (PC) och testade samtidigt med den undersökta kemikalier. Samtidig innebär att datorn måste prövas i varje analys, men inte mer än en dator behövs per test dag. Livskraft positiv kontroll bör vara inom 95% konfidensintervall av historiska data. Analysen uppfyller kriteriet för godkännande om medelvärdet livskraft PC vävnader uttryckt som% av den negativa kontrollen vävnader är 20%.

• EPI-200-SIT-analys Acceptans Kriterium 3: Standardavvikelse (SD)

  Hudirriterande spås från medelvärdet lönsamheten bestäms på 3 enkel vävnader och därmed variationen av vävnad replikat bör vara acceptabla. Analysen uppfyller kriteriet för godkännande om SD beräknas från enskilda viabilitet% vävnaden i tre identiska behandlades replikat är <18%.

Representativa resultat

Figur 1 Resultat för 6 testartiklar, NC och PC-styrning -. En del av automatiserade kalkylblad för beräkning av resultat. Testa kemikalier som minskar vävnad lönsamheten under 50% refererade till NC klassificeras som irriterande. Testet är optimerad för att ge resultat som är tillräckligt långt från den klassificering som cut-off (50% överlevnad) och därmed öka robustheten i analysen.

Material

Discussion

I den här filmen har vi visat EpiDerm testet Hudirritation (EpiDerm SIT) utvecklat och validerat in vitro hudirritation testning av kemikalier, inklusive kosmetiska och farmaceutiska substanser. När du utför denna metod är det viktigt att arbeta i aseptiska förhållanden och att strikt följa de validerade protokollet, eftersom avvikelsen från protokollet kan ge olika resultat. Vissa förändringar av analysen är möjliga, bör dock ändringar i protokollet diskuteras direkt med författarna.

Den enda begränsningen av denna metod är en möjlig störning av testämne med MTT slutpunkt. En färgad testämnet eller en som direkt minskar MTT (och därmed härmar dehydrogenas aktivitet i cellernas mitokondrier) kan störa MTT slutpunkt. Men dessa testämnet är ett problem endast om vid tidpunkten för MTT testet (dvs 42 timmar efter testämnet exponering) tillräckliga mängder av testämnet fortfarande är närvarande på (eller i) vävnader. Vid denna osannolika händelse, (sant) metabolisk MTT minskning och bidrag av en färgad testmaterial eller (falskt) direkt MTT minskning med provet kan kvantifieras genom ett förfarande som beskrivs i detalj i analysen Standard Operation Procedure som Mattek Corp