Denaturering Urea polyakrylamidgelelektrofores (urea SIDA)

Summary

Denaturering urea polyakrylamidgelelektrofores används för att separera enda DNA eller RNA upp till en gräns på 500 nukleotider. Urea i kombination med värme denaturerar prover och ostrukturerade enstaka delar migrera inom gelmatrisen enligt deras molekylvikt.

Abstract

Urea sida eller denaturering urea elektrofores polyakrylamidgel sysselsätter 6-8 M urea, som denaturerar sekundära DNA eller RNA strukturer och används för deras separation i en polyakrylamidgel matris baserad på molekylvikt. Fragment mellan 2 till 500 baser, med längd så små som en enda nukleotid, kan separeras med denna metod ^1. Migreringen av provet är beroende av den valda akrylamid koncentration. En högre andel av polyakrylamid beslutar lägre molekylvikt fragment. Kombinationen av urea och temperaturer på 45-55 ° C under gelen köra möjliggör separation av ostrukturerade DNA eller RNA-molekyler.

I allmänhet denna metod krävs för att analysera eller rena enstaka DNA eller RNA fragment, som syntetiserade eller märkta oligonukleotider eller produkter från enzymatisk klyvning reaktioner.

I denna video artikeln visar vi hur du förbereder och kör denaturering gel urea polyakrylamid. Tekniska tips ingår, i tillägg till det ursprungliga protokollet ^1,2.

Protocol

Den fullständiga och detaljerade text protokoll för detta experimentella proceduren finns i Aktuella protokoll i molekylärbiologi. Detaljerade steg-för-steg-instruktioner för montering av gelsandwichen och gel apparater kan hittas på BioRad webbplats ^3.

Utrustningskrav:
Glasplattor (inre och yttre)
10 cm-cell: 10,1 x 7,3 cm (inre platta), 10,1 x 8,2 cm (yttre platta), BioRad
20 cm-cell: 20 x 20 cm (inre platta), 20 x 22,3 cm (yttre platta), BioRad
0,5-1,5 mm gel kam och distanser
Gel gjutning stå
Gel apparater med lock och kablar
Högspänning strömförsörjning
Värmeblock eller vattenbad
Serologiska pipetter och pipett bistånd
Pipett och Pipettspetsar
Gel torktumlare eller skanner

Reagens och lösningar
Urea (ultrarent)
40% polyakrylamid lösning (29:1)
10 x TBE-lösning (tris-, EDTA-buffert)
Avjoniserat, destillerat vatten
TEMED
30% (w / v) ammonium persulfate lösning
0,5 x TBE-lösning
Formamid
EDTA
Xylen cyanol
Bromfenolblått
Metanol
Etanol

Volym	50 ml			60 ml			10 ml
Akrylamid koncentration	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g urea	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4,8	4,8	4,8
ml 40% Akryl (29:1)	12,5	15,625	18,75	15	18,75	22,5	2,5	3,125	3,75
ul 30% APS	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Fyll upp volymen med avjoniserat, destillerat vatten

Tabell 1: Reagenser och lösningar som krävs för olika akrylamid koncentrationer och volymer för att lösa enkelsträngad oligonukleotider

Gelsandwichen montering och gel förberedelse

1. Montera gelen enligt tillverkarens beskrivning och fixa gel i gel-casting kammare ^3. Använd 0,5-1,5 mm tjocka distanser.
2. Bered den tillämpliga polyakrylamid lösningen enligt gällande protokoll i molekylärbiologi eller som anges i tabell 1. För en denaturering akrylamid gel 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml gel lösning och en 10,1 x 8,2 cm x 1 mm gel 5 ml gellösningen är tillräcklig. Större geler används när de förväntade produkter / band är inom räckhåll för ett par baser, sedan en längre gel kommer att lösa banden med en skillnad på en enda nukleotid. Om den förväntade banden skiljer sig åt i mer än 10 nukleotider, kommer mindre geler vara lämpliga för att lösa fragment. Välj andelen polyakrylamid som passar dina separation krav, kommer en högre polyakrylamid koncentrationer lösa lägre molekylvikt fragment. Använd ultrarent urea och blanda med önskad mängd akrylamid. Lägg TBE-buffert till gelen mixen för att få en slutlig koncentration av 0,5 till 1 x TBE och fyll upp volymen med avjoniserat, destillerat vatten. Värm lösningen under 20 sekunder i mikron och blanda försiktigt. För större gel volymer upprepa detta steg tills lösningen är handen varm.
3. Häll gelen omedelbart med en serologisk pipett och en automatisk pipett stödet mellan de två glasskivor. Undvika att införa luftbubblor. Sätt kammen och låt gelen polymerisera i 30-60 minuter.

Sätt upp elektrofores apparater och prerun gelen

1. Demontera gelen från gjutning kammare och montering till gelen apparaten enligt tillverkarens anvisningar ^3.
2. Fyll den undre bufferten kammaren kvickhet löpande buffert (0.5-1 x TBE) att glasplattorna kommer att läggas utsamman 2-3 cm med buffert. Fyll den övre bufferten kammaren upp till toppen av gelen med rinnande buffert.
3. Ta försiktigt bort kammen och skölj brunnarna med rinnande buffert med hjälp av en pipett och gel lastning tips.
4. Fäst locket av gelen systemet och koppla in kablar till en hög spänning strömförsörjning. Innan du kan ladda dina prover du måste prerun gelen i minst 30 minuter för att värma gelen upp och ta bort återstående urea från gelen. Den optimala temperaturen bör ligga mellan 45-55 ° C. Undvik temperaturer över 60 ° C som band kan smeta eller glasskivor kunde spricka. Välj konstant watt för prerun (15-25 W per gel).

Provberedning

1. Under tiden förbereder dina prover. Därför lägger lämplig mängd 2 x gel lastning mix till ditt prov. Belastningen mix innehåller vanligen 90% formamid, 0,5% EDTA, 0,1% xylen cyanol och 0,1% bromfenolblått.
2. Innan proverna kan lastas på gelen måste proven värme denatureras genom uppvärmning av proverna mellan 70-90 ° C i några minuter.

Ladda och köra gelen

1. När prerun är klar tar du bort locket och spola fickorna grundligt som beskrivits tidigare som urea har lakas i brunnarna.
2. Applicera prover försiktigt från botten av fickan. Undvika att införa luftbubblor. Buffert måste tillämpas för att tömma fickor för att upprätthålla lika villkor under körningen.
3. Montera locket och köra gelen vid konstant watt för att bibehålla en gel temperatur på 55 ° C liknar prerun. Observera migrationen av markör färgämnen tills färgen nått den nedre änden av gelen. Den drivs varaktighet är beroende av andelen som används akrylamid, jonstyrka i bufferten och gel tjocklek. En kör kan pågå mellan 2-4 timmar.
   Kolla på temperaturen av gelen. En gel termometer kan hjälpa till att övervaka rätt temperatur under körning.

Process gelen

1. När färgen front har nått slutet av gelen lägger gelen ur den undre bufferten kammaren. Ta bort gelen från kammaren och lossa klämmorna. Dra bort distanserna och försiktigt isär de glasplåtar. Om det är nödvändigt skära bort den övre väl gelen del.
2. Försiktigt överföra gelen i en skål med gel fixering lösning (samma koncentration av TBE plus 5-10% metanol och etanol). Låt gelen i lösningen i 5-10 minuter och ändra bufferten två gånger.
3. Gelen är redo för vidare bearbetning med hjälp av en torktumlare vakuum gel eller direkt skanning av gelen.

Discussion

1. Bandet skärpa beror på flera faktorer. Provmängden lastas för skarpa band bör vara så liten som möjligt, dvs helst mellan 1-5 l. Däremot kan upp till 15 l laddas som fortfarande garanterar godtagbar lösning. Mindre provvolym ger skarpare band.
2. Bandet kvalitet är också beroende av gelen tjocklek. Tunnare gel, till exempel 0,75 mm visar bättre resultat än 1,5 mm tjock geler.
3. Formen på band kan även påverkas under gel lastning, om provet inte tillämpas lika i gelen fickan. Inklusive 10% glycerol i buffert hjälper till under gelen lastning och sjunker provet i brunnen lättare.
4. Ett annat potentiellt problem som är ansluten med provet buffert kan uppstå, om den förväntade produkt (er) körs på samma nivå som en av lastning färgämnen. Dessutom, om fluorescerande etiketter används, vissa färgämnen visar en fluorescerande signal vid en liknande våglängd. Om så är fallet ta bort ett färgämne eller alla färgämnen kan lösa detta problem. Då är det rekommenderat att köra färgen innehåller prov i en tom och en storlek standard.
5. Låg spänning i början av körningen bidrar också till att få skarpare band, som provet kommer in i gelen fram smidigt och den undviker att gel fickor kollaps på grund av hög spänning. En kort liten andel akrylamid stapling gel (4%) kan ha samma band-skärpning effekt.
6. En ofta stött på problem är gel "leende", som på grund av ojämn värmespridning genom gelen under elektrofores. Om gelen inte är omgiven av buffert, beroende på vilken gel systemet är anställd, bifoga en metallplatta på glasskivan stöder en jämn värmefördelning och kan avsevärt öka gelen kvaliteten.
7. Silanizing av glas plattor för större gel rekommenderas, eftersom den avsevärt förbättrar hanteringen av geler efter loppet, som geler har en tendens att fastna på glasplåtar.

Denaturering urea polyakrylamidgelelektrofores (urea-PAGE) är användbart för att analysera eller separata enda DNA eller RNA fragment samt radionucleotide-eller fluorescerande-märkta prover.