Biology

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/159

Jocelyn LeBlanc¹, Teresa Venezia Bowman¹, Leonard Zon¹

¹Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Abstract

Hematopoetik kök hücrelerin (HSC) bir organizmanın hayatı boyunca tüm farklılaştırılmış kan soy korumak pluripotent hücreler nadir bir nüfus. HSC işlevsel tanımı sulandırmak ışınlanmış bir alıcı, uzun vadeli tüm kan soy yeteneği olan bir nakledilen hücre. Bu atama memeli sistemlerinde seminal çalışma yıllardır tarafından kurulmuştur. Hematopoetik hücre transplantasyonu (HCT) ve fareyi ters genetik manipülasyonları kullanarak, HSC biyolojinin temel düzenleyici faktörleri açıkladı başlıyor, ama hala büyük ölçüde altında incelenmiştir. Son zamanlarda, Zebra balığı omurgalı hematopoez çalışmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Zebrafish içinde HCT kurulması bilim adamları HSC yönetmelik altında yatan yeni mekanizmalar ortaya zebrafish mevcut büyük ölçekli genetik ve kimyasal tarama metodolojileri kullanmak için izin verecektir. Bu makalede, biz yetişkin zebrafish HCT gerçekleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz zebrafish tüm böbrek iliği diseksiyon ve hazırlık zebrafish yetişkin hematopoez site, bu donör hücreleri ışınlanmış alıcı balık intrakardiyak enjeksiyon yoluyla dolaşıma giriş ve göstermektedir. Ayrıca, uzun vadeli sağlık artırmak için bir "YB" balık nakil sonrası bakım açıklar. Balık genel, nazik bakım öncesinde, esnasında ve sonrasında nakli, uzun vadeli değerlendirme (<3 ay) engraftman için gerekli bir aydan fazla Aşağıdaki prosedür, hayatta balık sayısını artırmak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol kurmak için kullanılan deneysel veriler başka bir yerde ilan edilecektir. Bu protokolün kurulması, büyük ölçekli zebrafish genetik ve nakli biyoloji birleşme için izin verecektir.

Protocol

Işınlama

Transplantasyon öncesi 25Gy 2 gün ışın tedavisi WT balık

Böbrek diseksiyonu

Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine balık su / litre) (500.000 hücreler donör balık başına ortalama) uygun sayıda floresan donörlerin Kurban
0.9X PBS +% 5 FCS +% 1 Penn strep (PBS + ") tüp içine böbrek Isolate
18 1 / 2 G iğne ile, daha sonra 10 ml şırınga ile 1 ml pipetlemeyin Break ile
Konik 50ml içine aktarın ve PBS ile doldurmak +
@ 1500rpm 8dk aşağı Spin
40micron filtresi aracılığıyla geniş hacim ve filtre, tekrar süspansiyon pelet dökeceğim
@ 1500rpm 8dk aşağı Spin
1ml PBS içinde tekrar süspansiyon, dışarı dökün +, Eppendorf tüpüne transfer
Saymak için: 10ul hücre sol + 90ul tripan mavi (şimdi 10X seyreltilir)
10ul hücre sol + 90ul PBS + (şimdi seyreltilir 10X)
Hemasitometre her iki tarafında her iki 10ul sol ekleyin, 5 dakika bekletin
Ölüm oranı büyük bir kutu (5x5), hesap hücre sayımı önemli.
Hücre / ml = (hücre sayısı) (10 ⁴⁾ (x10 dil faktörü)

Örnek - 60 hemasitometre sayılır hücrelerinin toplam 6.000.000 hücreleri
Örnek @ 1500rpm aşağı Spin 8dk
Uygun hücre konsantrasyonu elde etmek için tekrar süspansiyon pelet giriş hacmini
3ul WKM ve 2ul olan periferik kan enjekte etmek 5ul toplam hacmi
Örnek - 6.000.000 hücrelerinin toplam

alıcı başına 200.000 hücre nakli için

20 alıcı var

66.667 hücre / ul (200.000 hücre / 3ul) istiyor

90ul tekrar süspansiyon pelet (6.000.000 hücre / 66.667 hücre / ul)

Sadece bunun 60ul hakkında gerekli (20recip x 3ul)

Periferik kan emme

Tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine balık su / litre) WT balık taşıyıcı kan (donör ortalama 2.000.000 hücreleri ortalama) uygun sayıda Kurban
Antikoagülan: 1ml PBS seyreltik 1ul (3unit/ul) +
Heparin ile Coat pipetlemeyin ucu, pipetlemeyin ucu ile solungaç üzerinden bıçak, PBS kan +
Spin 1.5mL içinde tekrar süspansiyon 1500rpm 5min
Spin 1ml içinde tekrar süspansiyon 1500rpm 5min
40micron filtre süzülür
Yukarıdaki gibi hücre sayımı
Hücre / ml = (hücre sayısı) (10 ⁴⁾ (x10 dil faktörü)
Hesap ölüm
Tabanda hacmi yukarıdaki gibi hesaplayın

Enjeksiyon

Hamilton şırınga kullanarak her alıcı kalp içine enjekte 5ul
Nemli bir sünger tricaine balık (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100ml balık su) ve yer anestezisi
Kalp arkasında küçük bir ipucu Ekle
Kan küçük bir patlama (kalp vurmak anlamı) görene kadar kalp alanı çevresinde Poke -> görüyorum ama yine de enjekte değil Olabilir

Balık ICU - enjeksiyon sonrası