从组织外植体培养的人原代支气管上皮细胞

摘要

本文介绍了一种从人支气管气道组织外植体中培养原代人支气管上皮细胞的详细方法，包括在气液界面条件下进行分化生长。该方法可提供充足的原代细胞来源，用于研究气道上皮在人类肺部健康与疾病中的作用。

摘要

人支气管上皮细胞在疾病细胞模型构建以及研究辅料和药理学试剂对人上皮细胞功能与结构影响方面具有重要需求。本文详细描述了从肺部手术（如肺癌或肺减容手术）期间外科医生获取的支气管气道组织中培养支气管上皮细胞的方法。在获得伦理批准和知情同意后，外科医生在完成病理所需取材的基础上，将远离病变区域的支气管组织提供给我们。该组织随后被用作外植体来源，用于体外培养原代支气管上皮细胞。取长约0.5–1 cm、直径≤1 cm的支气管节段，用冷EBSS冲洗，并去除多余的实质组织。将支气管节段剪开并剪碎成2–3 mm大小的组织块³组织块。这些组织块用作原代细胞的来源。将100 mm培养皿用胶原蛋白（30 μg/mL）、纤连蛋白（10 μg/mL）和牛血清白蛋白（10 μg/mL）的混合物包被1–2小时后，在培养皿表面划出4–5道划痕，将组织块置于划痕区域，然后加入适用于上皮细胞生长的培养基（DMEM/Ham F-12，含添加剂），并将培养皿放入37°C、5% CO₂的培养箱中培养₂湿润的空气环境中培养。每3-4天更换一次培养基。上皮细胞从组织块向外生长，约3-4周形成直径约1.5 cm的环状结构。通过将组织块转移至新的预包被培养板中，可重复使用多达6次。细胞用胰蛋白酶/EDTA消化解离，收集后计数，并重新接种于T75 Cell Bind培养瓶中以扩增细胞数量。接种200万至300万个细胞的T75培养瓶，约4周可生长至80%融合度。扩增后的人原代上皮细胞可在气液界面培养并诱导其分化。本文所述方法可从新鲜分离的组织中获得大量人支气管上皮细胞，适用于将这些细胞作为疾病模型进行研究，以及用于药理学和毒理学筛选。

方案

人支气管节段是获取原代支气管上皮细胞的丰富来源。本文介绍了一种从新鲜分离的人支气管节段中培养和扩增人支气管上皮（HBE）细胞的实验方案。该方案包含以下五个部分：

1. 包被和划线100 mm培养皿
2. 制备支气管组织外植体
3. 支气管组织移植
4. 原代人支气管上皮细胞传代
5. 在Transwell上培养纤毛化人支气管上皮细胞

开始前 请注意，除非另有说明，所有步骤均在生物安全柜（BSC）中进行。请确保您已备齐本实验所需的所有材料。请阅读“材料、试剂与准备”部分，并确认您已在无菌条件下（即在生物安全柜或BSC中）配制好以下溶液：
包被储存液： 纤连蛋白（10 μg/ml）、牛血清白蛋白（BSA，10 μg/ml）和胶原蛋白（30 μg/ml）溶于Earle's平衡盐溶液（EBSS，无菌）中。
培养基： DMEM/Ham F-12 培养基，含添加剂、抗生素-抗真菌剂（1%）和胎牛血清（FBS，1%）
消化溶液： 胰蛋白酶/EDTA 储存液，以及含FBS（10%）的DMEM/F-12 培养基

1. 包被和划线100 mm培养皿：外植体将接种于100 mm培养....

讨论

本研究中，我们介绍了原代人支气管上皮细胞培养与扩增的详细方法。我们展示了如何将支气管组织的外植体和移植组织在促进上皮细胞生长的培养基中进行培养，从而持续获得人呼吸道上皮细胞，用于未分化（浸没式）和分化（气液界面培养）细胞模型的研究。这些细胞可用于更接近细胞真实生理环境的药物测试系统。非常重要的一点是，必须密切观察从外植体/移植组织中生长出的细胞，并确认其呈铺路石样形态。如果细胞形态不同，则应丢弃该批细胞及相应的外植体/移植组织，仅继续移植成功的组织。在我们的实验条件下，气液界面（ALI）培养的建立时间比先前报道的更长²。每隔一天更换一次气液界面的培养基，可能有助于促进上皮细胞更快地分化以及纤毛的生长。

我们希望本文所述方法能够鼓励您从组织外植体培养人支气管上皮细胞，并将这些细胞应用于您的研究体系中。毕竟，基于人源细胞的研究对于阐明人类肺部疾病机制中的重要通路以及基于细胞的 体外 针对人类细胞的毒性和功效筛选，以实现新药的早期评估并提高成功率。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白，粉末状	Sigma-Aldrich	A4919	用作包被溶液
I型胶原蛋白 0.1% 溶液 经无菌过滤	Sigma-Aldrich	C8919	用作包被溶液
人血浆来源的纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F2006	用作包被溶液
厄尔’Earle's 平衡盐溶液（EBSS，无菌）	Sigma-Aldrich	28888	用于组织冲洗及包被溶液
DMEM/Ham F-12	Sigma-Aldrich	D8437
FBS	Sigma-Aldrich	F1015	灭活后，分装并冷冻（-20℃）°C）；必要时使用新鲜的
抗生素-抗真菌剂稳定液	Sigma-Aldrich	A5955	分装至2 ml样品瓶中，冷冻（-20℃）°C）；根据需要使用新鲜的
牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A8412	BSA
牛垂体提取物	Sigma-Aldrich	P1476	BPE
表皮生长因子	Sigma-Aldrich	E9644	EGF
(±)-肾上腺素	Sigma-Aldrich	E1635
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634
转铁蛋白 人	Sigma-Aldrich	T8158
三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T6397
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0888
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T9935
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5368	PBS
70% 乙醇			用于消毒和清洁
24孔Transwell	康宁	3470
Corning 细胞培养瓶（T75）CLLBND	Fisher Scientific	05-539-104	这些培养瓶具有促进细胞贴附和生长的Cell Bind涂层
广谱细胞角蛋白单克隆抗体，FITC标记	Sigma-Aldrich	F3418	透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:250稀释度
抗体：E-钙黏蛋白（H108）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-7870	<强>不要进行透化处理； 使用1:250稀释比例，以A21207（Invitrogen）作为二抗
Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A21207	使用1:400稀释度
抗体：单克隆小鼠抗- α-平滑肌肌动蛋白-Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:100稀释度
抗体：波形蛋白（RV202）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-32322	透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:100稀释比例，以T2402（Sigma-Aldrich）作为二抗
兔抗小鼠TRITC	Sigma-Aldrich	T2402	使用1:400稀释度
抗体：CD31 或 PECAM-1（M-20）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-1506	<强>不要进行透化处理； 使用1:200稀释的驴抗山羊IgG-FITC作为二抗
驴抗山羊IgG-FITC	Santa Cruz Biotechnology, Inc.		使用1:100稀释度
含DAPI的Vectashield封片剂	Vector Laboratories	H-1200	避光冷藏；可标记细胞核，并在长期储存期间保持荧光
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1000	避光冷藏；长期储存期间可保持荧光活性
H–chst 染色液	Sigma-Aldrich	H6024	染色细胞核；使用1:10稀释比例，并用Vectashield H-1000封片
<强>其他要求： 培养箱、生物安全柜（BSC）、离心机、100 mm 培养皿、无菌离心管（15 ml、50 ml 和 2 ml）、无菌移液器吸头、手术刀柄及刀片、小型锐利剪刀、实验服和手套。上述物品可从您常用的供应商处采购。