Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo L'électroporation

Summary

Cette vidéo montre comment visualiser les voies axonales des groupes génétiquement définis des neurones de la moelle épinière embryonnaire de poulet en utilisant

Abstract

Emploi des éléments activateurs pour conduire l'expression de gènes rapporteurs dans les neurones est un paradigme largement utilisé pour le suivi de la projection axonale. Pour le suivi de projection axonale des interneurones spinaux chez les vertébrés, les gènes de germe de rapporteur en ligne ciblée rendement de marquage bilatéralement symétrique. Par conséquent, il est difficile de distinguer entre les ipsi-et contra-latéral axones saillie. Électroporation unilatérale dans le poussin du tube neural fournit un moyen utile de restreindre l'expression d'un gène rapporteur d'un côté du système nerveux central, et à suivre la projection axonale des deux côtés

Protocol

I. L'électroporation

La manipulation des œufs

1. Placez les oeufs dans un incubateur humidifié à l'ensemble 37-38 ° C, de préférence un incubateur avec un plateaux à bascule.
2. Embryon sont électroporées après environ 66 heures de l'incubation, quand ils ont atteint Hamburger & Hamilton (HH) stade de 18-20. A ce stade, la tête se trouve à angle droit avec le tronc (condition appelée flexion cervicale) et un vaste ensemble de vaisseaux sanguins extra-embryonnaires, comme antérieure, postérieure, droite et gauche veines vitellines doivent être considérés. C'est un stade optimal pour enhancer-dépendante l'expression spécifique ^1,3,4. Il est important de surveiller la température et l'humidité de l'incubateur, afin d'obtenir des embryons viables et synchronisés.
3. Après 66 heures d'incubation, retirer les oeufs de l'incubateur. Placez les oeufs à l'horizontale. Attendre 5-10 minutes. L'embryon est maintenant située au pôle supérieur de l'œuf.

Préparatifs

1. Préparer une solution de Hank avec de la pénicilline / streptomycine (P / S) (dilution 1:100).
2. Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre) pour microcapillaire.
3. Placer les électrodes (tungstène) dans micromanipulateur et connecter les électrodes au générateur d'impulsions (ECM 830).
4. Régler le générateur d'impulsions avec les paramètres suivants: 30V tension, le nombre d'impulsions - 3, la longueur de l'impulsion de 50 ms.
5. Préparer une pipette bouche, une aiguille de seringue et d'une bande.
6. Préparer un mélange souhaité de l'ADN (2-5μg/μl) et ajouter un colorant vert rapide.

Fenêtrage et l'électroporation

1. En utilisant une seringue, retirer 5-6 ml d'albumine de chaque œuf.
2. Avec un petits ciseaux d'ouvrir une fenêtre ovale à la face supérieure de l'œuf.
3. Humide l'embryon avec 0,5-1ml Hank + P / S solution.
4. Utiliser une pipette bouche, pour charger le verre avec le mélange de l'ADN microcapillaire.
5. Placez l'embryon avec sa queue vers vous. A ce stade, la moelle épinière d'embryon est clairement visible. Par conséquent, aucune des techniques contrastées sont nécessaires. La moelle épinière est scellé aux deux extrémités, la tête et la queue, mais si votre microcapillaire est assez mince, vous serez capable de percer un petit trou et pénètrent dans le tube neural à un angle faible. Un microcapillaire du bon diamètre doit être chargé facilement avec l'ADN, de pénétrer le tube sans l'endommager et libérer l'ADN avec une expiration régulière.
6. Injecter de l'ADN à l'aide d'une pipette bouche. Le colorant vert devrait s'étendre de l'extrémité de la queue jusqu'à l'vésicules du cerveau en développement.
7. Placer les électrodes en parallèle à la fermeture du tube neural, aussi près que vous pouvez, sans toucher le tube lui-même et le pouls. Au moment de l'impulsion, les électrodes doivent être couverts avec du liquide pour permettre la conductivité électrique. Habituellement, le montant de Hank ajouté à la mendicité est suffisante. Si ce n'est pas ajouter une goutte de Hank, juste avant l'impulsion.
8. Retirez délicatement les électrodes et le joint de la fenêtre avec un ruban. Il est important de sceller l'œuf entièrement à prévenir le dessèchement de l'embryon au cours de la période d'incubation suivant.
9. Placez le dos d'œufs dans l'incubateur.

II. La moelle épinière à livre ouvert la préparation

Détachement de la moelle épinière de l'embryon

1. Retirez l'embryon eletroporated, à E6, de l'œuf et le placer dans une boîte de Pétri enduit de silicone contenant du PBS.
2. Coupez les membranes et étirer l'embryon sur sa face ventrale utilisant des broches pour le tenir.
3. L'utilisation d'un de tungstène forte microcapillaire faire une incision longitudinale le long de la plaque de toit, de la rhombencéphale jusqu'à la queue.
4. Faire deux autres incisions longitudinales sur les deux côtés de la moelle épinière, en détachant les ganglions de la racine dorsale (DRG) loin de la moelle épinière.
5. Détachez la plaque au sol à partir des tissus à partir de la queue à l'rhombencéphale, laissant intacte la moelle épinière.
6. Coupez la moelle épinière dans une section transversale à l'aide de ciseaux fins rhombencéphale et la séparer du corps.

Fixation

1. Passez le cordon médullaire isolée dans un nouveau plat de Pétri enduit de silicone contenant du PBS, utilisant des broches pour le tenir, à partir du rhombencéphale à la queue production d'une préparation plate-montage.
2. Verser le CPE de l'antenne et le remplacer par du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate salin.
3. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.

L'immunohistochimie

1. Transférer la moelle épinière fixée dans un flacon contenant l'anticorps primaire dans le PBS.
2. Incuber avec agitations douces pendant la nuit à 4 ° C.
3. Laver l'anticorps X5 fois avec du PBS, chaque lavage pendant 1 heure avec agitation douce.
4. Ajouter anticorps secondaire et incuber avec les agitations douces pendant la nuit à 4 ° C.
5. Laver l'anticorps X5 fois avec du PBS, chaquelaver pendant 1 heure avec agitation douce.

Montage livre ouvert pour l'imagerie

1. Étaler la graisse ou de silicone en forme de rectangle sur une diapositive et goutte à goutte de PBS à l'intérieur.
2. Placez la moelle épinière étirée au milieu du rectangle à l'aide des pinces et tirer le liquide autour de lui avec une pipette Pasteur.
3. Placer 1-2 gouttes de supports de montage sur la moelle épinière et couvrir avec lamelle. Squash c'est pour éviter les bulles d'air.
4. Gardez les diapositives dans l'obscurité à 4 ° C.
5. Inspectez la moelle épinière en utilisant la microscopie confocale.

Discussion

L'électroporation d'ADN plasmidique dans l'embryon de poulet évolue comme une technique puissante pour l'expression ectopique vivo. La combinaison des exhausteurs spécifiques, et l'électroporation chiches fournit un outil rapide et efficace pour déchiffrer les voies axonales d'un groupe de neurones génétiquement défini ^1,3,5. Utilisant le système Cre / LoxP et les systèmes d'amplification Gal4/UAS peut augmenter le niveau et la durée d'expression. L'image qui émerge est une divergence complexe de signaux axonaux qui découle de sous-populations interneurone, défini par la direction de leurs projections axonales. En outre, simultanée marquage moléculaire et spatiale limitée de deux populations de neurones peut être atteint. Ainsi, fournissant des informations sur l'architecture des circuits neuronaux ^3.