多电极阵列的犁鼻上皮录音

Summary

多电极阵列（MEA）的录音提供了一个人口众多的神经元电活动的研究方法。在这里，我们目前的一个多边环境协定的准备的细节，从小鼠犁鼻上皮的记录，同时刺激组织。

Abstract

了解神经回路需要方法，同时从许多神经元记录。对于

Protocol

第1部分。电气记录仪器

1. 我们使用一个平面与10微米平面氮化钛，氮化硅绝缘电极的多电极阵列（ALA的科学仪器）。被安排在60个电极组成一个中心，中心间距30微米的5X6格的两个领域。 （其他配置也有可能与记录面直径在10微米的电极比孤立的单个神经元的活动方面有较大的电极。）
2. 电信号放大（放大1000倍），使用MEA 1060放大器（ALA科学仪器）。信号采集采用数据采集卡（美国国家仪器）和自定义数据采集软件（也可以购买商业软件）在10千赫。
3. 该组织举行的“千年生态系统评估”，由尼龙网（53微米），这是连接到一个自定义的插入，紧贴内的“千年生态系统评估”文化管环。

第2部分。液体输送仪器

1. 连续灌流，其中我们提供林格解决方案（115毫米氯化钠，5毫米钾氯化物，2 mM的钙氯化物，2 mM的镁氯，25 mM的钠碳酸氢盐，10毫米的HEPES，和10 mM的D -（+保证组织）葡萄糖）从HPLC泵。刺激被执行注射到高效液相色谱阀和流过和循环之间切换。 HPLC泵和注射机器人的注射泵提供与林格氏液。
2. 林格液保存在恒温水浴（ISOTEMP 105）在42 ° C，在整个实验过程，并不断冒泡的_95％O 2 / _5％的CO 2。准备一个单独的无葡萄糖瓶中林格注射泵为后盾。林格氏液传递到组织，使用一个307 HPLC泵（吉尔森）3毫升/分钟的速度。在一个典型的5-6小时的实验，1 L每个林格氏液就足够了。
3. 在整个实验过程中，该组织是连续灌流37℃林格氏液。加热器探头定位直接组织以上。
4. 刺激交付使用吉尔森215液体处理程序机械臂。刺激存储在橡胶覆盖的玻璃小瓶，吉尔森软件的控制下，机械臂灌注行提供的刺激，而保持恒定流速和压力。
5. HPLC阀（循环从事/不从事）的状态是由一个电压，这是由收购的计算机作为一个额外的通道，以确保与神经元的活动的同步记录的代表。

第3部分。准备MEA和刺激给药装置

1. 进行解剖之前，填写“千年生态系统评估与BSA在dH2O在室温下至少5分钟。
2. 使用林格氏液热身冒泡和冲洗“千年生态系统评估”千年生态系统评估“置于冰上。
3. 总理的液体处理和HPLC泵根据制造商的指示。

第4部分。 VNO夹层

1. 执行剥离之前，填写冒泡林格氏液置于冰上2 60x15毫米的培养皿中。同时填充2 Sylgard涂层与同样大小的林格氏液，并置于冰上的培养皿。冰寒在解剖使用的热身冒泡林格50毫升。
2. 鼠标是颈椎脱位， _通过二氧化碳窒息牺牲。
3. 从口边双边切口，下颌线平行，到了脑后。加入沿颈后2削减和消除头的背侧部分，留下连接到鼠标的下颚。
4. 用细剪刀，切割之间的组织和上颚骨分开的骨组织的两侧。
5. 使用＃3钳，剥离腭部组织暴露鼻腔。
6. 使用小剪刀或手术刀，上部2门牙两侧之间自由骨犁鼻囊切开。
7. 使用＃3镊子，拿起犁鼻囊，扁骨和在培养皿上冰的地方。透过浸泡的步骤应该是在不到3分钟。
8. 将菜立体显微镜下，用反射光照亮。在使用＃3钳的时间，从一个VNO移除骨胶囊。一方面要稳定揪心从尾结束，另一方面剥离骨离的VNO，小心不要损坏VNO骨胶囊。
9. 当骨被删除，转移到Sylgard涂层的培养皿的VNO。使用其他VNO剩下的菜。切换透射光照明。
10. 采用微型剪刀或＃5镊子，血管分开，沿切割边缘的VNO VNO。在这一点上，你会完全从血管分离的神经表。
11. 内部（树突）朝上放置的VNO。使用＃3钳，锚VNO Sylgard组织的一个角落。去皮，从基底使用钳位举行聚四氟乙烯涂层剃须刀刀片的一个小片段的椎板神经上皮。在浅的角度（<30 °从盘表面）刀片是最好的。
12. 使用的玻璃吸管，从盘的传输神经上皮的一块“千年生态系统评估”。位置与树突状方犁鼻器上的电极领域的顶级。删除多余的林格的解决吸管。放入数组的以及网状组织持有人举行的地方VNO，并填写冷冻林格溶液。

第5部分。记录

1. 放置在一个多边环境协定的1060放大器“千年生态系统评估”，并直接组织的上述立场加热器探头。
2. 要确定适当的加热探头安置，刺激与林格氏液含有2秒50毫米钾（摩尔钠取代）。调整定位，以尽量减少钾溶液的神经反应延迟。
3. 组织Superfuse与林格加热45分钟至1小时前录音，让组织适应环境的解决方案。
4. 电信号保存到磁盘使用自定义的录音软件。

第6部分。数据分析

1. 离线数据分析，可以使用原始的电极录音。例如，我们在响应特定的配体测量记录细胞的放电率的变化。由此产生的数据集很大，可以用来解决许多不同的问题;熟悉编程或分析语言（C，MATLAB，R，Python中，或类似的）是必需的。

第7部分。代表性的成果

本制剂通常是稳定的，足够的记录，从6个小时，产生大量的数据（6小时的录音，由60个电极）。

图1显示整个数组的一半同时活动的快照。时间窗口跨越400毫秒。请点击这里看到图1的放大版本。

图2：一个典型的实验，我们刺激与感兴趣的特定化合物为10秒。此跟踪是100倍稀释后的雌性小鼠尿液的反应的一个例子。请点击这里看大图图2。

Discussion

多电极阵列记录，让我们一个人口众多的神经元的同步活动进行监控的能力。这是一个有用的工具，用于探测感官系统的性能，特别是VNO。与主要的嗅觉系统，VNO检测液相的刺激。此外，VNO是一种异质性的组织。有大约300个不同类型的^鼠标 1受体可能与不同的反应概况， 。结合机械臂的多边环境协定的录音，让我们能够可靠地提供液体刺激的神经元和身份回应electrophysiologically庞大和多样化的人口。此外， 在体外 VNO的稳定性，可以多次重复刺激的时间。

此前，这项技术已用于研究VSNS的感官性状²鼠标尿，以及作为一个可靠的检测尿中³个人配体识别。在将来，这种技术可能是非常有用的进一步配体的发现和VNO感官性状特征。