Multielectrode vomeronasal उपकला ऐरे रिकॉर्डिंग

Summary

Multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग (विदेश मंत्रालय) न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी के विद्युत गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. यहाँ, हम एक विदेश मंत्रालय की तैयारी के विवरण प्रस्तुत करने के लिए माउस vomeronasal उपकला से रिकॉर्ड जबकि एक साथ ऊतक उत्तेजक.

Abstract

तंत्रिका सर्किट को समझना तरीकों कई न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने के लिए एक साथ की आवश्यकता है. के लिए

Protocol

भाग 1. विद्युत रिकॉर्डिंग इंस्ट्रुमेंटेशन

1. हम 10 सुक्ष्ममापी फ्लैट टाइटेनियम नाइट्राइड सिलिकॉन नाइट्राइड के साथ अछूता इलेक्ट्रोड के साथ एक planar multielectrode सरणी (ALA वैज्ञानिक उपकरण) का उपयोग करें. 60 इलेक्ट्रोड दो क्षेत्रों में 30 सुक्ष्ममापी की रिक्ति केंद्र के लिए केंद्र के साथ एक 5x6 ग्रिड से मिलकर व्यवस्था कर रहे हैं. (अन्य विन्यास भी संभव हो रहे हैं, व्यास में एक रिकॉर्डिंग सतह 10 सुक्ष्ममापी के साथ इलेक्ट्रोड एकल न्यूरॉन्स की गतिविधियों को अलग करने के मामले में बड़ा इलेक्ट्रोड की तुलना में बेहतर हैं.)
2. विद्युत संकेतों (1000x प्रवर्धन) परिलक्षित कर रहे हैं विदेश मंत्रालय के 1060 प्रवर्धक (ALA वैज्ञानिक उपकरण) का उपयोग. सिग्नल 10 एक डाटा अधिग्रहण (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) कार्ड और कस्टम डाटा अधिग्रहण (एक भी वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर खरीद कर सकते हैं) सॉफ्टवेयर का उपयोग kHz पर हासिल किया है.
3. ऊतक नीचे विदेश मंत्रालय पर एक नायलॉन (53 सुक्ष्ममापी) मेष, जो जो विदेश मंत्रालय की संस्कृति ट्यूब की अंगूठी के अंदर snugly फिट बैठता है एक कस्टम डालने से जुड़ा हुआ है के द्वारा आयोजित किया जाता है.

भाग 2. लिक्विड डिलिवरी इंस्ट्रुमेंटेशन

1. ऊतक निरंतर superfusion है, जो हम घंटी समाधान (115 मिमी सोडियम क्लोराइड, 5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 2 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 2 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, 25 मिमी सोडियम बिकारबोनिट, 10 मिमी HEPES, और 10 मिमी डी (+ की आपूर्ति के द्वारा गारंटी की आवश्यकता है एक HPLC पंप से)) ग्लूकोज. उत्तेजनाओं एक HPLC वाल्व में इंजेक्शन और प्रदर्शन के माध्यम से प्रवाह और पाश के बीच स्विचन द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं. दोनों HPLC पंप और इंजेक्शन रोबोट सिरिंज पंप घंटी समाधान के साथ की आपूर्ति कर रहे हैं.
2. घंटी समाधान 42 पर एक गर्म पानी स्नान (105 ISOTEMP) ° सी में प्रयोग भर रखा है और लगातार 95% ₂ हे / 5% सीओ ₂ के साथ bubbled . ग्लूकोज के बिना एक घंटी है के अलग फ्लास्क सिरिंज पंप समर्थन के लिए तैयार है. घंटी समाधान ऊतक 3 एमएल / मिनट की दर पर 307 HPLC पंप (Gilson) का उपयोग करने के लिए दिया है. एक ठेठ 5-6 घंटे के प्रयोग में, प्रत्येक घंटी के समाधान के 1 एल के लिए पर्याप्त है.
3. प्रयोग के दौरान, ऊतक लगातार 37 डिग्री सेल्सियस है घंटी समाधान के साथ superfused है. एक हीटर जांच ऊतक सीधे ऊपर तैनात है.
4. उत्तेजनाओं Gilson 215 तरल हैंडलर रोबोट भुजा का उपयोग कर वितरित कर रहे हैं. उत्तेजनाओं रबर छाया हुआ कांच की शीशियों में संग्रहित कर रहे हैं, और Gilson सॉफ्टवेयर के नियंत्रण के तहत, रोबोट भुजा छिड़काव लाइन उत्तेजनाओं बचाता है, जबकि निरंतर प्रवाह दर और दबाव बनाए रखा हैं.
5. HPLC वाल्व (पाश लगे / नहीं लगे) के राज्य में एक बिजली के वोल्टेज, जो अधिग्रहण कंप्यूटर द्वारा एक अतिरिक्त neuronal गतिविधि के साथ तुल्यकालन सुनिश्चित चैनल के रूप में दर्ज है द्वारा प्रतिनिधित्व किया है.

भाग 3. विदेश मंत्रालय और प्रोत्साहन डिलिवरी डिवाइस की तैयारी

1. विच्छेदन प्रदर्शन करने से पहले, विदेश मंत्रालय dH2O में BSA के साथ अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए भरने.
2. विदेश मंत्रालय कुल्ला गर्म bubbled घंटी के समाधान का उपयोग और बर्फ पर विदेश मंत्रालय जगह.
3. तरल हैंडलर प्रधानमंत्री और HPLC पंप निर्माता के निर्देशों के अनुसार.

भाग 4. VNO विच्छेदन

1. विच्छेदन प्रदर्शन से पहले bubbled घंटी और बर्फ पर समाधान जगह के साथ 2 60x15 मिमी पेट्री डिश को भरने. इसके अलावा घंटी और बर्फ पर समाधान और जगह के साथ एक ही आकार के 2 Sylgard लेपित पेट्री डिश को भरने. विच्छेदन के दौरान प्रयोग के लिए एक अतिरिक्त गर्म bubbled घंटी के 50ml शांत रहो.
2. माउस सीओ ₂ ग्रीवा अव्यवस्था से पीछा asphyxiation के माध्यम से बलिदान है.
3. मुंह की ओर से द्विपक्षीय चीरों बनाओ, जबड़े की रेखा के समानांतर चल सिर के पीछे. गर्दन के पीछे के साथ दो कटौती के साथ जुड़ें और सिर के पृष्ठीय हिस्सा निकालने के लिए, कम माउस संलग्न जबड़े छोड़ने.
4. ठीक कैंची का प्रयोग, ऊतक और ऊपरी जबड़े की हड्डी से अस्थि ऊतक अलग के दोनों ओर के बीच में कटौती.
5. # 3 संदंश का प्रयोग, तालू ऊतक बंद छील करने के लिए नाक गुहा का पर्दाफाश.
6. छोटे कैंची या एक स्केलपेल के बीच और 2 ऊपरी सामने दाँत के दोनों ओर पर हड्डी से vomeronasal कैप्सूल मुक्त कटौती का उपयोग करना.
7. # 3 संदंश का प्रयोग, फ्लैट और बर्फ पर पेट्री डिश में हड्डी की जगह द्वारा vomeronasal कैप्सूल लेने. विसर्जन के माध्यम से कदम कम से कम 3 मिनट में किया जाना चाहिए.
8. Stereomicroscope तहत पकवान परिलक्षित प्रकाश के साथ प्रबुद्ध रखें. एक VNO से एक # 3 संदंश का उपयोग कर समय पर बोनी कैप्सूल निकालें. दुम का अंत और दूसरे हाथ से VNO से दूर हड्डी छील, मनोरंजक देखभाल लेने के लिए VNO नुकसान नहीं द्वारा बोनी कैप्सूल स्थिर एक हाथ का प्रयोग करें.
9. जब हड्डी निकाल दिया जाता है, एक Sylgard लेपित पेट्री डिश VNO हस्तांतरण. अन्य VNO के लिए शेष पकवान का प्रयोग करें. प्रेषित प्रकाश रोशनी स्विच करें.
10. सूक्ष्म कैंची या # 5 संदंश का प्रयोग, रक्त वाहिका से VNO की बढ़त के साथ काटने से VNO अलग. आप इस बिंदु पर होगातंत्रिका पूरी तरह से रक्त वाहिका से अलग शीट है.
11. आंतरिक वृक्ष के समान () ऊपर की ओर के साथ VNO रखें. # 3 संदंश का प्रयोग, ऊतक के एक कोने में Sylgard VNO लंगर. बेसल Teflon लेपित एक उस्तरा ब्लेड एक क्लैंप के साथ आयोजित के एक छोटे से टुकड़ा का उपयोग लामिना से तंत्रिका उपकला पील. एक उथले कोण (<30 पकवान की सतह से °) पर ब्लेड होल्डिंग सबसे अच्छा है.
12. एक गिलास विंदुक का प्रयोग, पकवान से विदेश मंत्रालय के लिए तंत्रिका उपकला का टुकड़ा हस्तांतरण. वृक्ष के समान ऊपर की ओर के साथ इलेक्ट्रोड क्षेत्र के शीर्ष पर VNO स्थिति. एक विंदुक के साथ अतिरिक्त घंटी समाधान निकालें. सरणी के कुएं में जाल ऊतक धारक प्लेस जगह में VNO पकड़ है, और ठंडा है घंटी समाधान के साथ भरें.

भाग 5. रिकॉर्डिंग

1. एक विदेश मंत्रालय 1060 प्रवर्धक में विदेश मंत्रालय प्लेस और ऊतक के ऊपर सीधे हीटर जांच की स्थिति.
2. उचित हीटर जांच नियुक्ति की पुष्टि करने के लिए, घंटी समाधान 2 सेकंड के लिए 50 मिमी पोटेशियम (equimolar सोडियम के लिए एवजी) युक्त के साथ उत्तेजित. स्थिति समायोजित करने के लिए पोटेशियम समाधान के लिए तंत्रिका प्रतिक्रिया के विलंबता को कम.
3. ऊतक acclimate करने की अनुमति रिकॉर्डिंग से पहले से 45 मिनट पहले 1 घंटे के लिए गर्म घंटी के समाधान के साथ ऊतक Superfuse.
4. विद्युत संकेतों कस्टम रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिस्क पर सहेजी जाती हैं.

भाग 6. डेटा विश्लेषण

1. ऑफ़लाइन डेटा विश्लेषण कच्चे इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग का उपयोग किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम विशेष रूप से ligands के जवाब में दर्ज की कोशिकाओं की फायरिंग दर में परिवर्तन को मापने के. परिणामी डेटा सेट बड़े हैं और कई अलग अलग सवालों के पते के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक प्रोग्रामिंग या विश्लेषण भाषा (सी, Matlab, आर, अजगर, या इसी तरह के) के साथ परिचित की आवश्यकता है.

भाग 7. प्रतिनिधि परिणाम

यह तैयारी आम तौर पर काफी स्थिर से 6 घंटे के लिए रिकॉर्ड करने के लिए, डेटा (60 इलेक्ट्रोड से 6 घंटे की रिकॉर्डिंग के) की एक बड़ी राशि उपज है.

चित्रा 1. सरणी के एक आधा भर में एक साथ गतिविधि का एक स्नैपशॉट में दिखाया गया है. समय खिड़की 400 एमएस spans. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 2 एक ठेठ प्रयोग में, हम 10 सेकंड के लिए ब्याज की विशेष यौगिकों के साथ उत्तेजित. इस ट्रेस 100 गुना पतला महिला माउस मूत्र के लिए एक प्रतिक्रिया के एक उदाहरण है. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

Discussion

Multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग हमें न्यूरॉन्स की एक बड़ी आबादी के साथ - साथ गतिविधि पर नजर रखने की क्षमता की अनुमति देते हैं. यह एक संवेदी प्रणाली के गुण जांच, विशेष रूप से VNO के लिए एक उपयोगी उपकरण है. मुख्य घ्राण प्रणाली के विपरीत, VNO तरल चरण में उत्तेजनाओं का पता लगाता है. इसके अलावा, VNO एक विषम ऊतक है. वहाँ ^एक माउस में रिसेप्टर्स की लगभग 300 अलग अलग प्रतिक्रिया प्रोफाइल के साथ संभाव्यतः प्रकार हैं. विदेश मंत्रालय रोबोट भुजा के साथ संयुक्त रिकॉर्डिंग हमें मज़बूती से न्यूरॉन्स और एक प्रतिक्रिया electrophysiologically पहचान के एक बड़े और विविध जनसंख्या के लिए तरल उत्तेजनाओं देने के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, इन विट्रो में VNO की स्थिरता एक उत्तेजना के कई दोहराता के लिए समय की अनुमति देता है.

इससे पहले, इस तकनीक माउस मूत्र के जवाब में VSNs का संवेदी गुण की ^जांच 2 के रूप में अच्छी तरह ^के रूप में 3 मूत्र में मौजूद व्यक्ति ligands की पहचान के लिए एक विश्वसनीय परख के रूप में सेवा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. भविष्य में, इस तकनीक को आगे ligand खोज करने के लिए अत्यधिक उपयोगी और VNO का संवेदी गुणों निस्र्पक में हो सकता है.