Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו"גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אקסונים commissural הגבי בעמוד השדרה חוליות 1 כבר מערכת מודל יסולא בפז שבו כדי לזהות אותות הדרכה האקסון. כאן אנו מתארים ב assay חוץ גופית, "assay ארגון מחדש", כי כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של אותות החיצונית והרמה הפנימית על האוריינטציה של אקסונים commissural 2. Assay זו פותחה על ידי אנשים רבים במעבדות של ג'יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן (ראה התודות לפרטים נוספים) וגירסאות של assay זה שימשו כדי להדגים את פעולות ארגון מחדש של מולקולות הנחיה מפתח האקסון, כולל BMP chemorepellent ב הגג צלחת 3,4 ופעילות chemoattractive של Netrin1 5 ו סוניק הקיפוד (ששש) 6 בצלחת הרצפה בחוט השדרה.
Explants הכולל 2-3 שכבות הגבי שני שלישים של עמוד השדרה הם גזור מיום עובריים (E) 11 חולדות תרבותי בשלוש ג'ל קולגן ממדי 7. Explants E11 השדרה הגבי מכילים נוירונים commissural שזה עתה נולד, אשר ניתן לזהות על ידי ביטוי axonal שלהם גליקופרוטאין, Tag1 8. במהלך 30-40 שעות בתרבות, מסלול האקסון commissural הוא סיכם אלה explants הגב עם כמובן זמן דומה לזה ראיתי in vivo. מסלול זה axonal ניתן לערער על ידי הצבת או רקמות מבחן או במצטבר תא COS להביע מולקולה מועמד איתות במגע עם אחד הקצוות לרוחב של explant הגבי. אקסונים Commissural הארכת באזור של רקמת צירף יגדל תחת השפעת הצלחת שני גג אנדוגני אותות מן הרקמה לרוחב חוץ רחמי. המידה שבה הם אקסונים commissural ההתמצאות בנסיבות אלו ניתן לכמת. שימוש assay זה, אפשר גם לבחון את ההסתפקות של אות מסוים לארגון מחדש של אקסונים commissural 3,4 כמו גם הצורך לאות זה לכוון את מסלול commissural 9.
פרוטוקול
חלק 1: הכנת מצרפי של תאים transfected COS באמצעות טיפות תליה
- זרעים COS-7 (COS) תאים בצלחות תרבות 35mm. כאשר הם מגיעים 80% confluency, 1μg transfect הביטוי הפלסמיד לתוך התאים באמצעות Lipofectamine2000 לפי הפרוטוקול של היצרן.
- כדי להכין תלוי טיפות, לשאוב את המדיום transfection ולשטוף את התאים COS transfected עם פוספט 1ml של 1x פתרון שנאגרו (PBS). התייחס תאים עם 0.5ml של המדיום האנזים ללא תא דיסוציאציה במשך 15 דקות. הוסף 1ml של תמיסה של Opti-ממ סרום + 1x פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין (P / S....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גורמים קריטיים הקובעים הצלחה בביצוע הזה assay הם הראשון, רקמות לא צריכים להיות מטופלים עם dispase לתקופה ממושכת מדי, טיפול כזה יביא הרקמה להיות דביק מאוד לאחר ירידה הכדאיות. שני, קולגן חייב להיות דרוך לחלוטין ושמר על הקרח כמה שיותר. זה יהיה קשה יותר ויותר להתמודד אם זה מתחיל לשקוע, כלומר להפוך ורוד. שלישית, המחט טונגסטן חייב תמיד להיות כל הזמן מאוד חדה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
פרוטוקול זה פותח במעבדות של ג'יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן. אנשים רבים, כולל קונרד Basler, אן Calof, תומאס Edlund, פיל המילטון, Domna Karagogeos, אריאל רואיז אני Altaba ו Toshiya יאמאדה נקבע כיצד explants תרבות של חוט השדרה של קולגן. מרישה Placzek ומארק טסייה-לאבין חלוץ בטכניקה של צמיחה באמצעות האקסון מ ב explants במבחנה כאמצעי זיהוי מולקולות הנחיה האקסון. עבודה במעבדה באטלר נתמך על ידי תרומות של מצעד הפרוטות ו R01 NS063999 מ-NIH / NINDS.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מקורות
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
