Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Resumen

Este ensayo evalúa la capacidad de una molécula de señalización, la proteína morfogenética ósea 7 aquí (BMP7), para reorientar axones de la comisura. Un explante de la médula espinal dorsal de embriones se cultivaron junto a un conjunto de células secretoras de COS los factores de crecimiento candidato. Reorientado axones de la comisura de crecimiento en el explante se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Resumen

Axones de la comisura dorsal de la médula espinal de vertebrados han sido ^un modelo de un sistema de valor incalculable en el que para identificar las señales de guía axonal. Aquí se describe un ensayo in vitro ", el ensayo de reorientación", que se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de las señales intrínsecas y extrínsecas en la orientación de los axones de la comisura ^2. Este ensayo fue desarrollado por numerosas personas en los laboratorios de Jane Dodd, Jessell Thomas y Andrew Lumsden (ver agradecimientos para más detalles) y las versiones de este ensayo se utilizaron para demostrar las actividades de la reorientación de las principales moléculas axón orientación, incluyendo la chemorepellent en el BMP techo de placa de ^3,4 y las actividades de chemoattractive Netrin1 ⁵ y Sonic Hedgehog (Shh) ⁶ en la placa de piso en la médula espinal.

Explantes que comprende 2-3 segmentos de la dorsal de dos tercios de la médula espinal se disecan a partir del día embrionario (E) 11 ratas y se cultivaron en tres dimensiones geles de colágeno ^7. E11 espinal dorsal explantes contienen recién nacido neuronas comisurales, que pueden ser identificadas por su expresión axonal de la glicoproteína, Tag1 ^8. En el transcurso de 30-40 horas en la cultura, la trayectoria de los axones comisurales se resume en estas explantes dorsal con un tiempo similar a la observada en vivo. Esta trayectoria axonal puede ser impugnada mediante la colocación de cualquiera de los tejidos de prueba o un agregado de células COS que expresan una molécula de señalización candidato en contacto con uno de los bordes laterales de la explante dorsal. Axones de la comisura que se extienden en los alrededores del tejido adjunta crecerá bajo la influencia de la placa del techo y las señales endógenas de los tejidos laterales ectópico. El grado en que los axones de la comisura se reorientan en estas circunstancias se pueden cuantificar. El uso de este ensayo, es posible tanto a examinar la suficiencia de una señal en particular para reorientar axones de la comisura ^3,4 y la necesidad de que esta señal para dirigir la trayectoria de la comisura ^9.

Protocolo

Parte 1: Preparación de los agregados de células transfectadas COS el uso de gotas colgantes

1. COS-7 semillas (COS), las células en placas de cultivo de 35 mm. Cuando llegan a un 80% 1 g confluencia, transfectar del plásmido de expresión en las células utilizando Lipofectamine2000 según el protocolo del fabricante s.
2. Para preparar las gotas colgantes, aspirar el medio de transfección y aclarar las células COS transfectadas con 1 ml de solución tampón fosfato 1x (PBS). Tratar las células con 0,5 ml de enzima libre de medio de disociación celular durante 15 minutos. Añadir 1 ml de una solución de Opti-MEM + 1x penicilina / estreptomicina / glutamina ....

Discusión

Los factores críticos que determinan el éxito en la realización de este ensayo son en primer lugar, el tejido no debe ser entendido con dispasa demasiado prolongada de un período, este tratamiento se traducirá en el tejido a ser muy pegajoso y con disminución de la viabilidad. Dos, el colágeno debe estar perfectamente preparado y mantenerse en hielo tanto como sea posible. Cada vez será más difícil de manejar si se empieza a configurar, es decir, a su vez de color rosa. Tres, la aguja de tungsteno debe estar siempre muy.......