תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

Summary

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב.

Abstract

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. מערכות אלו מציעות מבחר רחב של מצעים פלורסנט אופטימיזציה עבור מגוון רחב של מכשור הדמיה. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב. ישנם שני צעדים באמצעות מערכת זו: שיבוט וביטוי של החלבון של עניין כמו היתוך SNAP-תג, וסימון של התמזגות עם המצע SNAP-התג של בחירה. הצמד תג הוא חלבון קטן מבוסס על אדם O

Protocol

ציפוי CHO-K1 תאים:

1. הוסף 50-100μl של CHO-K1 תאים שעברו trypsinized על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי להשלים 6ml של ה-F-12k.
2. מערבבים את ההשעיה על ידי תא pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן 300 aliquot μl של השעיה תא trypsinized היטב כל סטרילית 8-קאמרית Lab-Tek II החדרים Coverglass עם # 1.5 בורוסיליקט coverglass לתאי (Nalgene Int Nunc;. Product # 155409; מגרש: 100808-8-0).
3. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לילה.

Transfection חלוף של CHO-K1 תאים עם pSNAP-ADRB2 pSNAP ו-H2B:

1. בדוק את התרבות התאים בתאי זרע ביום הקודם לחפש צפיפות התאים ובריאות.
2. תווית המספר המתאים של צינורות microfuge.
3. במנדף זרימה למינרית, להגדיר תערובות transfection מורכבים על פי תרשים הדוגמה הבא, או באמצעות 0.3 מיקרוגרם pSNAP ADBR2-DNA בקרה פלסמיד או 0.3 מיקרוגרם של ה-DNA pSNAP-H2B בקרה פלסמיד, 1 μl של D2 TransPass ו 1 μl של TransPass V לכל תגובה.

   הפלסמיד	מספר תגובות	μl של המדיום סרום ללא	μl של D2 TransPass	μl של TransPass V	μl של ה-DNA פלסמיד	μl של D2/reaction TransPass	μl של TransPass V / תגובה	ng של DNA / תגובה	ה-DNA קונצרט כלשהו. (Ng / μl)	μl של ה-DNA פלסמיד תגובה /
   Snap-ADRb2	5	236.5	5	5	3.5	1	1	300	472.34	0.7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515.89	0.6
   ללעוג	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Untransfected	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. ראשית, לערבב החופשי בסרום F-12k עם ה-DNA פלסמיד מתאים, ואז מוסיפים את מגיב D2 TransPass transfection, ואז מוסיפים את מגיב V TransPass transfection. מערבבים את המרכיבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים לאחר תוספת של כל מגיב.
5. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
6. במהלך הדגירה, רוחצים תאים פעם אחת עם 600 μl של DMEM להשלים ולהוסיף 450 μl של DMEM מלאה מדגם זה.
7. הוסף 50 μl של התערובת transfection מורכב מדגם זה, לאט בצורה טיפה חכם.
8. דגירה דגימות לילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2.

Snap-Cell TMR כוכב תיוג של CHO-K1 תאים transfected transiently עם pSNAP-ADRB2 pSNAP ו-H2B:

1. הסר בזהירות את התקשורת transfection מורכב מכל מדגם ידי יניקה ואקום. שטפו פעמיים עם תאים μl 600 של שלמה F-12k ולהחליף התקשורת היטב כל אחד עם 600 μl של שלמה F-12k.
2. מיקס מדיה לצבוע תיוג על ידי הוספת 995 μl של שלמה F-12k ו 51 μl 0.6 SNAP-Cell mM TMR-Star המצע. הריכוז הסופי של snap-Cell Star-TMR צריך להיות 3mm. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב לאחר תוספת של המצע.
3. מוציאים בזהירות התקשורת צמיחה ממדגמים ולהוסיף 200 μl של התקשורת תיוג לצבוע היטב כל אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 30 דקות.
4. בעוד דוגמאות דוגרים, להכין Hoechst 33342 פתרון מכתים הגרעין של דגימות ידי ערבוב 1 μl של 33,342 Hoechst, trihydrochloride, הידראט (10 מ"ג / מ"ל ​​מים פתרון, פתרון 16.2 מ"מ; בדיקות Invitrogen מולקולרית) בתוך 10 מ"ל של שלמה F-12k .
5. הסר את המדיה ממדגמים כל ולהוסיף 600 μl של הפתרון Hoechst לדלל לטעום כל אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 5 דקות.
6. לשטוף דגימות שלוש פעמים עם 600 μl של שלמה F-12k.
7. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 30 דקות נוספות כדי לאפשר fluorophore מאוגדים לנטרל מתוך התאים.
8. לאחר 30 דקות, לשנות את התקשורת על SNAP-Cell דגימות בפעם האחרונה והמשך הדמיה.
9. תמונת תאים באמצעות Apotome Zeiss Axiovert 200 מיליון מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

נציג תוצאות

באיור 1. להלןכמה תוצאות נציג דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניאון סטנדרטית של COS-7 תאים חיים כי מביעים SNAP-תג fusions. זו התמונה הראשונה הופעות חיות COS-7 תאים להביע pSNAP-H2B (הגרעיני היסטון) שכותרתו עם Cell-SNAP TMR-Star. PSNAP-H2B לבנות נוצר באמצעות pSNAP-תג (מ ') וקטור. התאים תויגו עם SNAP-Cell Star-TMR במשך 30 דקות ו counterstained עם Hoechst 33342 (כחול) עבור גרעינים. פלואורסצנטי ורוד מדגים את כיסוי של חלבון פלואורסצנטי אדום שבו היסטון קיים בנוסף הקרינה הכחול המציין את הגרעין. הביטוי של החלבון H2B מזוהה בבירור ובקלות.

איורים 2 ו -3. אלה לצד שתי תמונות להראות לחיות COS-7 תאים transfected transiently עם pSNAP-ADRβ2.
תאים תויגו עם Cell-SNAP TMR-Star (אדום) counterstained עם Hoechst 33342 (כחול). PSNAP-ADRβ2 לבנות נוצר באמצעות pSNAP-תג (מ ') וקטור. התאים תויגו עם SNAP-Cell Star-TMR במשך 30 דקות ו counterstained עם Hoechst 33342 (כחול) עבור גרעינים. פלואורסצנטי אדום מעיד על קיומו של שטח פני התא חלבון קולטן ADRB2 תוך כחול פלואורסצנטי מזהה את הגרעין.

Discussion

ישנם מספר משתנים המשפיעים על התוצאות שנצפו כגון אינטנסיביות, לייזר מיקוד, יכולות הציוד, עדשות השתמשו וכו 'photostability של fluorophore קובע כמה מהר את הקרינה חייב להיות בשבי לפני דהייה.

שיטה זו של תיוג חלבון צדדי מתאים ליישומים רבים. Snap-תג קליפ תג טכנולוגיות תיוג הספציפי של חלבונים היתוך עם בדיקות סינתטי לאפשר היבטים שונים של תפקוד החלבון, כולל מגוון רחב של תהליכים דינמיים בתאים חיים וב lysates התא. Snap-, קליפ, MCP ו-ACP-תג טכנולוגיות לספק צדדיות פשטות יוצאת דופן הדמיה של חלבונים בתאים חיים קבוע ללימוד חלבונים במבחנה. יצירת לבנות גן יחיד התשואות חלבון היתוך מתויג מסוגל להרכיב הצמדה קוולנטי למגוון של קבוצות פונקציונליות, כולל fluorophores, ביוטין, או חרוזים. החלבון של עניין יש משובטים והביע רק פעם אחת ולאחר מכן את היתוך ניתן להשתמש עם מגוון מצעים ניאון עבור יישומים במורד רבים כגון תיוג חלבון בו זמנית בתוך תאים חיים, לוקליזציה של חלבונים טרנסלוקציה, הדופק לרדוף ניסויים, הפנמה מחקרים קולטן , תא סלקטיבית משטח תיוג, חלבון לנתץ מבחני, גילוי חלבון SDS-PAGE, cytometry זרימה, תפוקה גבוהה מבחני מחייב צלחות microtiter, ניסויים אינטראקציה biosensor, ו סריג מבוססי מבחני מחייב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-K1 Cells	ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers	Nalge Nunc international	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)	Invitrogen	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid	New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid	New England Biolabs	N9179S	0010811