Summary
SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır.
Abstract
SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Bu sistemler, görüntüleme enstrümantasyon bir dizi için optimize edilmiş floresan substratların geniş bir seçki sunuyor. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır. Bu sistemi kullanarak iki adım vardır: SNAP-tag füzyon, füzyon seçim SNAP-tag substrat etiketlenmesi ve protein gibi ilgi klonlama ve ifade. SNAP-etiket insan O dayalı küçük bir protein
Protocol
CHO-K1 Hücreler Kaplama:
- F-12K tam 6ml standart protokollere göre tripsinize CHO-K1 hücreleri 50-100μl ekleyin.
- Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme hücre süspansiyonu karıştırın, 1.5 borosilikat coverglass odaları (tripsinize hücre süspansiyonu daha sonra steril bir 8-odacık Lab-Tek II odacıklı Coverglass her kuyuya kısım 300 ul Nalgene Nunc Int. Ürün # 155.409; Yeri: 100808-8-0).
- Numuneleri 37 ° C,% 5 CO 2 gece boyunca inkübe edin.
PSNAP ADRB2 ve pSNAP-H2B ile CHO-K1 Hücre Geçici Transfeksiyon
- Hücre yoğunluğu ve sağlık için önceki gün seribaşı hücre kültürü odaları kontrol edin.
- Mikrofuge'de tüplerin uygun sayıda etiketleyin.
- Laminer akış kaputu, transfeksiyon kompleks karışımlar 0.3 mikrogram pSNAP ADBR2 Kontrol Plazmid DNA veya pSNAP-H2B Kontrol Plazmid DNA, TransPass D2 1 ul ve 1 TransPass V ul 0.3 mikrogram ile aşağıdaki örnek grafiğe göre ayarlamak her reaksiyon için.
plazmid reaksiyon sayısı serum orta, ul TransPass D2, ul TransPass V, ul plazmid DNA, ul TransPass D2/reaction, ul TransPass V / reaksiyon, ul DNA / reaksiyon ng DNA kons. (Ng / ul) plazmid DNA / reaksiyon, ul SNAP-ADRb2 5 236,5 5 5 3,5 1 1 300 472,34 0,7 H2B-Snap 5 237 5 5 3 1 1 300 515,89 0,6 Sahte 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 Untransfected 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 - İlk olarak, F-12K uygun plazmid DNA ile serum serbest, daha sonra sonra TransPass V Transfeksiyon Reaktif eklemek TransPass D2 Transfeksiyon Reaktif ekleyip karıştırın. Bileşenlerin her reaktifin ilavesinden sonra birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırın.
- Reaksiyon oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, tam DMEM 600 ul kez hücreleri yıkayın ve her bir örnek için 450 tam DMEM ul ekleyin.
- Yavaş yavaş ve akıllıca bir damla moda, her bir örnek 50 ul transfeksiyon karmaşık bir karışımı ekleyin.
- 37 ° C,% 5 CO 2 gecede örnekleri inkübe edin.
SNAP-geçici pSNAP ADRB2 ve pSNAP-H2B ile transfekte CHO-K1 Hücre Hücre TMR Yıldız Etiketleme:
- Dikkatle vakum emme her örnekten transfeksiyon karmaşık ortamı çıkarın. F-12K tam iki kez 600 ul hücreleri yıkayın ve F-12K tam 600 ul ile her bir kuyunun medya yerine.
- 995 F-12K ve 51 ul 0.6 mM SNAP-Cell TMR-Star substrat ul ekleyerek boya etiketleme medya karıştırın. SNAP-Cell TMR-Star final konsantrasyon 3mm olmalıdır. Substrat eklenmesinden sonra karıştırmak için birkaç kez aşağı ve yukarı Pipet.
- Dikkatle örneklerinden büyüme ortamı çıkarın ve her bir kuyunun 200 ul boya etiketleme medya ekleyin. 37 numune ° C'de,% 5 CO 2 30 dakika.
- Tam F-12K 10 ml; örnekleri kuluçka iken, Hoechst 33.342, trihydrochloride, trihidrat (Invitrogen Molecular Probes suda 10 mg / ml solüsyon, 16,2 mM çözüm) 1 ul karıştırılarak Hoechst 33.342 çözüm örnekleri nükleer boyanması için hazırlamak .
- Tüm örneklerde medyayı çıkartın ve her numune için seyreltilmiş Hoechst çözüm 600 ul ekleyin. 37 numune ° C'de,% 5 CO 2 5 dakika.
- F-12K tam 600 ul örnekleri üç kez yıkayın.
- Numuneleri 37 ° ° C'de,% 5 CO 2 adi fluorofor hücrelerin diffüz izin vermek için ek bir 30 dakika .
- 30 dakika sonra, SNAP-Cell örnekleri, son bir kez medya değiştirmek ve görüntüleme geçin.
- Zeiss Apotome Axiovert 200M floresan mikroskop kullanılarak Görüntü hücreler.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1.SNAP-tag füzyonlar ifade canlı COS-7 hücreleri standart floresan mikroskopi kullanılarak floresan görüntüleme bazı temsilcisi sonuçları. Bu ilk görüntü, SNAP-Cell TMR-Star etiketli pSNAP-H2B (histon nükleer) ifade COS-7 hücreleri canlı gösterir. PSNAP-H2B inşa pSNAP-tag (m) vektörü kullanılarak oluşturulmuştur. Hücreler 30 dakika boyunca SNAP-Cell TMR-Star etiketli ve çekirdekleri Hoechst 33.342 (mavi) ile zıt. Pembe floresan kırmızı floresan histon protein çekirdeği gösteren mavi floresan yanı sıra mevcut kaplamayı göstermektedir. H2B protein ifadesi, açık ve kolay bir şekilde tespit edilir.
Şekil 2 ve 3 Bu önümüzdeki iki görüntü geçici pSNAP-ADRβ2 transfekte canlı COS-7 hücreleri göstermektedir.
Hücreler SNAP-Cell TMR-Star (kırmızı) etiketli ve Hoechst 33.342 (mavi) ile zıt. PSNAP ADRβ2 inşa pSNAP-tag (m) vektörü kullanılarak oluşturulmuştur. Hücreler 30 dakika boyunca SNAP-Cell TMR-Star etiketli ve çekirdekleri Hoechst 33.342 (mavi) ile zıt. Mavi floresan çekirdeği tanımlar iken kırmızı floresan hücre yüzeyinde reseptör protein ADRB2 varlığını gösterir.
Discussion
Fluorofor fotostabilite solma önce ele olmalıdır ne kadar hızlı floresan belirler odak, lazer yoğunluğu, ekipman özellikleri, lens kullanılır, vs gibi gözlenen sonuçlar etkileyen birçok değişken vardır.
Protein etiketleme Bu yöntem, çok yönlü ve birçok uygulama için uygundur. Sentetik problar ile füzyon proteinleri belirli bir etiketleme için SNAP-etiket ve CLIP-etiket teknolojileri bir çok canlı hücreler ve hücre lizatları dinamik süreçleri de dahil olmak üzere protein fonksiyonu çeşitli yönleriyle sağlar. SNAP, CLIP, MCP-ve ACP-etiket teknolojileri, canlı ve sabit hücrelerin proteinlerin görüntüleme ve proteinlerin in vitro çalışmada, sadelik ve olağanüstü çok yönlülük sağlar. Tek bir gen yapının oluşturulması fluorophores, biotin veya boncuk gibi çeşitli fonksiyonel gruplar, bir kovalent bağ kurma yeteneğine sahip etiketli füzyon proteini verir. Ilgi protein klonlanmış ve ifade sadece bir kez ve daha sonra füzyon floresan substratlar canlı hücrelerin içinde aynı anda protein etiketleme, protein yerelleştirme ve translokasyon, darbe-kovalamaca deneyler, reseptör içselleştirilmesi çalışmaları gibi çok sayıda alt uygulamalar için çeşitli kullanılabilir olmalıdır , seçici hücre yüzeyinde etiketleme, protein testleri, SDS-PAGE, akış sitometri, microtiter plakalar, biyosensör etkileşim deneyleri yüksek verim bağlayıcı deneyleri protein algılama ve FRET-temelli bağlayıcı deneyleri aşağı çekme.
Disclosures
Bu makalede kullanılan reaktifler ve araçlar üreten New England Biolabs yazarları tarafından istihdam edilmektedir.
Acknowledgments
Kai Johnsson
Ivan Correa
Andreas Brecht
Katrin Müentener
Chris Noren
Luo Sun
Ming Xu
Theodore Davis
Salvatore Russello
Aihua Zhang
Inca Ghosh
Elissa Maunus
Nicholas Labarthe
James MacFarland
John Buswell
Brenda Desmond
James Ellard
Don Tarak
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | |
| Serum free F-12K | |||
| Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalge Nunc international | 155409 | Lot: 100808-8-0 |
| DMEM | |||
| H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen | H3570 | 470519 |
| Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 |
| Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 |
| SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 |
| pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 |
| pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |
References
- Johnsson, K. Visualizing biochemical activities in living cells. Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).
- Johnsson, K. SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function. NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).
