SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop
Summary
Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.
Abstract
De abnormale vouwen en polymerisatie van de β-amyloïde (Aß) peptide is gedacht aan de neurodegeneratieve cascade bij de ziekte van Alzheimer pathogenese starten<sup> 1</sup>. Aß is voornamelijk een 40 – of 42-aminozuur peptide die gevoelig is voor zelf-aggregatie in de β-sheet-rijke amyloid fibrillen die gevonden worden in de kernen van cerebrale seniele plaques in de ziekte van Alzheimer. Steeds meer aanwijzingen dat een laag moleculair gewicht, oplosbare Aß multimeren giftiger zijn dan fibrillair Aß amyloid<sup> 2</sup>. De identificatie en kwantificatie van laag-en hoog moleculair gewicht multimere Aß soorten in hersenweefsel is een essentiële doelstelling bij de ziekte van Alzheimer onderzoek, en de methoden die ook gebruikt kunnen worden toegepast op de identificatie en karakterisatie van giftige multimeren in andere proteopathies<sup> 3</sup>. Natuurlijk voorkomende Aß multimeren kan worden gedetecteerd door SDS-polyacrylamide gel elektroforese, gevolgd door immunoblotting met Aß-specifieke antilichamen. Echter, de scheiding en detectie van multimere Aß vereist het gebruik van sterk geconcentreerde corticale homogenaten en antigen retrieval in kleine poriegrootte nitrocellulose membranen. Hier beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, scheiding van eiwitten door SDS-PAGE, en antigeen-epitoop / Western blotting met antilichaam 6E10 van de N-terminale gebied van het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, we consequent te sporen Aß monomeren, dimeren, trimeren, tetrameren en hoger molecuulgewicht multimeren in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.
Protocol
Discussion
Ondanks het belang van Aß aggregatie in de pathogenese van de ziekte van Alzheimer 1,4,5, hebben weinig studies beschreven of gekwantificeerd de distributie van diverse Aß multimeren in menselijke corticale weefselmonsters 2. Veelgebruikte immunohistochemische technieken niet mogelijk voor de discriminatie van verschillende soorten multimere Aß in vaste corticale weefsel. In losgemaakte corticale weefsel homogenaten, kan Aß multimeren worden gescheiden en biochemisch beoordeeld met behulp van g…
Acknowledgements
Veel dank aan Elaine Pranski en Carolyn Suwyn voor een uitstekende technische bijstand en Harry LeVine III, M. Paul Murphy, en Marla Gearing voor belangrijke gesprekken. De financiering werd verstrekt door RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, de Woodruff Foundation en de Emory University Research Committee.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
