Summary

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Published: April 23, 2010
doi:

Summary

Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

Abstract

De abnormale vouwen en polymerisatie van de β-amyloïde (Aß) peptide is gedacht aan de neurodegeneratieve cascade bij de ziekte van Alzheimer pathogenese starten<sup> 1</sup>. Aß is voornamelijk een 40 – of 42-aminozuur peptide die gevoelig is voor zelf-aggregatie in de β-sheet-rijke amyloid fibrillen die gevonden worden in de kernen van cerebrale seniele plaques in de ziekte van Alzheimer. Steeds meer aanwijzingen dat een laag moleculair gewicht, oplosbare Aß multimeren giftiger zijn dan fibrillair Aß amyloid<sup> 2</sup>. De identificatie en kwantificatie van laag-en hoog moleculair gewicht multimere Aß soorten in hersenweefsel is een essentiële doelstelling bij de ziekte van Alzheimer onderzoek, en de methoden die ook gebruikt kunnen worden toegepast op de identificatie en karakterisatie van giftige multimeren in andere proteopathies<sup> 3</sup>. Natuurlijk voorkomende Aß multimeren kan worden gedetecteerd door SDS-polyacrylamide gel elektroforese, gevolgd door immunoblotting met Aß-specifieke antilichamen. Echter, de scheiding en detectie van multimere Aß vereist het gebruik van sterk geconcentreerde corticale homogenaten en antigen retrieval in kleine poriegrootte nitrocellulose membranen. Hier beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, scheiding van eiwitten door SDS-PAGE, en antigeen-epitoop / Western blotting met antilichaam 6E10 van de N-terminale gebied van het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, we consequent te sporen Aß monomeren, dimeren, trimeren, tetrameren en hoger molecuulgewicht multimeren in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van verduidelijkt weefsel homogenaten Dounce homogeniseren niet vastgelegde corticale weefsel in 4 keer het volume van ijskoude buffer (0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing [Ca + + – en Mg + +-free] plus 2x proteaseremmer cocktail [Santa Cruz]) met ongeveer 30 zelfs pestle slagen (dat wil zeggen toe te voegen 400μl buffer tot 100 mg weefsel). Spin homogenaten gedurende 5 minuten bij 3000 g (4 ° C). Verwijder voorzichtig verduidelijkt supernatants en op te slaan fracties van…

Discussion

Ondanks het belang van Aß aggregatie in de pathogenese van de ziekte van Alzheimer 1,4,5, hebben weinig studies beschreven of gekwantificeerd de distributie van diverse Aß multimeren in menselijke corticale weefselmonsters 2. Veelgebruikte immunohistochemische technieken niet mogelijk voor de discriminatie van verschillende soorten multimere Aß in vaste corticale weefsel. In losgemaakte corticale weefsel homogenaten, kan Aß multimeren worden gescheiden en biochemisch beoordeeld met behulp van g…

Acknowledgements

Veel dank aan Elaine Pranski en Carolyn Suwyn voor een uitstekende technische bijstand en Harry LeVine III, M. Paul Murphy, en Marla Gearing voor belangrijke gesprekken. De financiering werd verstrekt door RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, de Woodruff Foundation en de Emory University Research Committee.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets   Santa Cruz Biotechnology Sc-29130 1 tablet in 25ml buffer
BCA Protein Assay kit   ThermoFisher Scientific 23225  
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark   Invitrogen EI0002  
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)   Invitrogen LC1676  
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)   Invitrogen NP0004  
SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard   Invitrogen LC5925  
Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well   Invitrogen EC6625BOX  
Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size   Invitrogen LC2000  
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)   Invitrogen LC1675  
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)   Invitrogen LC3675  
SimplyBlue SafeStain   Invitrogen LC6060 Will not interfere with immunostaining
ATX Ponceau S Red staining solution   Sigma Aldrich 09276 Will not interfere with immunostaining
Kapak heat sealable plastic sample pouches   Fisher Scientific 0181225AA  
6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16)   Covance SIG-39320 Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB
Tween 20   Sigma Aldrich P2287  
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep)   GE Healthcare Life Sciences NA931-1ML Dilute at 1:10,000
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate   ThermoFisher 34077  
Kodak Biomax MR Film   Carestream Health 870 1302  

References

  1. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
  2. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  3. Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
  4. Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
  5. Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
  6. Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
  7. Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).

Play Video

Cite This Article
Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).

View Video