A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Resumen

Metagenómica bibliotecas fragmentos contiguos gran archivo de secuencias genómicas de los microorganismos sin necesidad de cultivo previo. Generación de un procedimiento simplificado para la creación y la selección de bibliotecas de metagenómica tanto, es útil para una eficiente investigación de alto rendimiento en las propiedades genéticas y metabólicas de los ensambles microbianos inculto. En este caso, los protocolos claves se presentan en el vídeo, que nos proponemos es el formato más útil para describir con precisión un largo proceso que, alternativamente, depende de la instrumentación robótica y (humanos) de intervenciones manuales. En primer lugar, la robótica empleada para detectar clones de la biblioteca en las membranas de macrochips de alta densidad, cada uno de los cuales puede contener colonias de duplicados de veinticuatro planchas biblioteca de 384 pocillos. La automatización es esencial para este procedimiento no sólo por la precisión y velocidad, pero también debido a la miniaturización de la escala necesaria para adaptarse a la gran cantidad de clones de la biblioteca en la organización espacial de alta densidad. Una vez generado, el próximo demostró cómo las membranas macrochips pueden ser examinados por los genes de interés usando versiones modificadas de los protocolos estándar para el etiquetado de la sonda, la hibridación de membrana, y la detección de la señal. Hemos complementado la demostración visual de estos procedimientos, con descripciones detalladas por escrito de los pasos a seguir y los materiales requeridos, todos los cuales están disponibles en línea junto con el vídeo.

Protocolo

1. Hibridación procedimiento

Un tubo de hibridación tomar 1 o 2 membranas (tamaño 22 por 22 cm). Utilice 50 ml de mezcla de hibridación y 0,5 mg de sondas de ADN (10 ng / ml concentración final) por tubo de hibridación. Para obtener los mejores resultados, utilice gel purificado de ADN como sonda. Si la ampliación de la preparación de la sonda, aumentar el número de tubos en lugar de aumentar la cantidad de reactivos por tubo.

Preparación de la sonda (0,5 mg de ADN):

1. Diluir 15 l de solución de reticulación con 60 l de agua.
2. Diluir el ADN a 10 ng / ml con agua a 50 l de volumen total en un mic....

Discusión

El procedimiento de extracción no ha sido optimizado. Sin embargo, el procedimiento de agotamiento dado en las instrucciones del fabricante (2 lavados cada 10 min en etanol al 100%, un lavado de 1 hora a 60 ° C en el 0,5% SDS) es insuficiente. Por lo menos una noche de incubación en el 100% de etanol es necesario para disolver el producto de reacción ECF; de incubación de varios días en el 100% de etanol no parece tener efectos adversos sobre la capacidad de sondear la membrana. Tratamiento del fabricante SDS también parece ser insuficiente.......

Materiales

Combinación pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685