Biology

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/201

Vinh D. Pham¹, Tsultrim Palden¹, Edward F. DeLong¹

¹Division of Biological Engineering, Department of Civil and Environmental Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Summary

Abstract

Metagenómica bibliotecas fragmentos contiguos gran archivo de secuencias genómicas de los microorganismos sin necesidad de cultivo previo. Generación de un procedimiento simplificado para la creación y la selección de bibliotecas de metagenómica tanto, es útil para una eficiente investigación de alto rendimiento en las propiedades genéticas y metabólicas de los ensambles microbianos inculto. En este caso, los protocolos claves se presentan en el vídeo, que nos proponemos es el formato más útil para describir con precisión un largo proceso que, alternativamente, depende de la instrumentación robótica y (humanos) de intervenciones manuales. En primer lugar, la robótica empleada para detectar clones de la biblioteca en las membranas de macrochips de alta densidad, cada uno de los cuales puede contener colonias de duplicados de veinticuatro planchas biblioteca de 384 pocillos. La automatización es esencial para este procedimiento no sólo por la precisión y velocidad, pero también debido a la miniaturización de la escala necesaria para adaptarse a la gran cantidad de clones de la biblioteca en la organización espacial de alta densidad. Una vez generado, el próximo demostró cómo las membranas macrochips pueden ser examinados por los genes de interés usando versiones modificadas de los protocolos estándar para el etiquetado de la sonda, la hibridación de membrana, y la detección de la señal. Hemos complementado la demostración visual de estos procedimientos, con descripciones detalladas por escrito de los pasos a seguir y los materiales requeridos, todos los cuales están disponibles en línea junto con el vídeo.

Protocol

1. Hibridación procedimiento

Un tubo de hibridación tomar 1 o 2 membranas (tamaño 22 por 22 cm). Utilice 50 ml de mezcla de hibridación y 0,5 mg de sondas de ADN (10 ng / ml concentración final) por tubo de hibridación. Para obtener los mejores resultados, utilice gel purificado de ADN como sonda. Si la ampliación de la preparación de la sonda, aumentar el número de tubos en lugar de aumentar la cantidad de reactivos por tubo.

Preparación de la sonda (0,5 mg de ADN):

Diluir 15 l de solución de reticulación con 60 l de agua.
Diluir el ADN a 10 ng / ml con agua a 50 l de volumen total en un microtubo con tapón de rosca.
Desnaturalizar el ADN durante 5 minutos en agua hirviendo.
Rápida transferencia de hielo y deje enfriar por 5 minutos. Girar brevemente.
Añadir 50 l de tampón de reacción y mezclar suavemente.
Añadir 10 l de etiquetado reactivo y mezcle suavemente.
Añadir 50 l de la diluido reticulante solución del paso 1 y mezclar suavemente. Vortex suavemente y girar brevemente.
Se incuba a 37 ° C durante 30 min.
Mantener en hielo durante 2 h, o añadir un volumen equivalente de 100% de glicerol y almacenar a -20 ° C.

Nota: El uso del agua suministrada con el kit. Mantenga todos los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario.

Membrana de la preparación y la hibridación

Precaliente 50 ml de buffer de hibridación y el tubo de hibridación a 60 ° C.
Añadir el tampón de hibridación de la sonda de hibridación. Enrollar la membrana (s) y añadir al tubo de hibridación. (Si la adición de dos membranas por tubo, rodar por primera vez una membrana completamente, y luego enrollar la membrana de otras en la parte superior en la misma dirección.)
Incubar el tubo en hibridación a 60 ° C durante por lo menos ½ h. (Asegúrese de que la membrana (s) empaparse a fondo.)
Transferencia de aproximadamente 1 ml de tampón de hibridación con una pipeta largo del tubo de hibridación con el tubo que contiene la sonda marcada. Vortex suavemente y girar brevemente. Transfiera la mezcla de nuevo al tubo de hibridación.
Se incuba a 60 ° C durante la noche.

Nota: Use pinzas y guantes para manipular las membranas. Que permite combinar contenido de los tubos de hibridación con cuidado, porque demasiada agitación provocará la formación permanente de espuma indeseable. Las membranas se debe agregar en condiciones húmedas; remojo en una solución tampón de hibridación o agua si es necesario y escurra el exceso de líquido antes de añadir.

2. Procedimiento de detección de

Membranas de lavado

Precaliente el tampón de lavado principal a 60 ° C. (Use el horno microondas y / o placa de calentamiento).
Si hay dos membranas en el tubo de hibridación de una, la transferencia de una membrana de un lugar limpio, tubo de precalentado, hibridación vacío.
En pocas palabras Enjuague el tubo de hibridación con 50 ml de tampón de lavado principal.
Añadir unos 100 ml de tampón de lavado principal al tubo de hibridación y se incuba a 60 ° C durante 10 min.
Repita los pasos 3 y 4.
Transferencia de membrana para el lavado de contenedores y se incuban con al menos 250 ml de tampón de lavado secundario a temperatura ambiente durante 5 min.
Repita el paso 6.

Nota: Las membranas se pueden mantener en el tampón de lavado secundario a temperatura ambiente durante un máximo de hora y media antes de la generación de la señal.

Generación de señal y detección (procedimiento de una membrana)

Cinta de dos piezas de SaranWrap plano sobre la mesa (una para el paso 2 y otro para el paso 4).
Con cuidado, escurrir el exceso de tampón de la membrana por tocar las esquinas de la membrana contra el lado del contenedor y la transferencia de la membrana en el SaranWrap (lado de la muestra hacia arriba).
Vierta 6-7 ml de reactivo ECF sobre la membrana y el abrigo veces Saran sobre la membrana. Distribuir cuidadosamente reactivo ECF sobre la membrana moviendo suavemente una Kimwipe el SaranWrap. Incubar durante 5 min.
Escurrir el exceso de reactivo ECF de la membrana y transferirlo a nuevas SaranWrap, envuelva veces sobre la membrana, y sellar los bordes con cinta adhesiva. Cubrir la membrana con papel de aluminio. Incubar durante 1-2 horas.
Prepare la placa de cristal del escáner mediante la distribución de 2.1 ml de reactivo ECF sobre la placa de vidrio. A continuación, traslado de la membrana en la placa de vidrio (lado de la muestra hacia abajo) y distribuir otro 1-2 ml de reactivo ECF sobre la membrana. Superposición con SaranWrap y empuje con cuidado todas las burbujas de aire fuera de la membrana. (Usted puede colocar una placa rígida en la parte superior de la SaranWrap para mantener la membrana presiona contra la placa de vidrio.)
Utilice el Fuji FLA-5100 escáner de fluorescencia ("un láser de una imagen de" modo) con los siguientes valores: excitación 473 nm, los filtros de detección LPB (510 nm), la resolución de 50 micras, la graduación de la señal de 16 bits, CH1 400 V. (Scan tarda unos 15-20 minutos por membrana con un tamaño 22 por 22 cm.)

Opcional:
Deje reposar durante 2-4 horas (o más).
Repita el análisis como en el paso 6.

3. Extracción y almacenamiento de procedimiento (NUF versión)

La transferencia de la membrana y el 100% ethanol e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave.
Reemplazar con etanol fresca 100% e incubar durante la noche a temperatura ambiente. (Membrana puede permanecer en etanol durante varios días.)
Vuelva a colocar el etanol con agua destilada y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
Añadir 100 ml de agua y 5 ml de SDS al 10% (final de 0,5% SDS) a un tubo de hibridación y mezclar suavemente. Añadir membrana.
Se incuba a 80 ° C durante 1 h.
La transferencia de la membrana en un recipiente limpio y vacío.
Añadir 500 ml de agua y 5 ml de SDS al 10% (final de 0,1% SDS) un vaso de precipitados y calentar a ebullición vigorosa en el horno de microondas.
Vierta el punto de ebullición cerca de 0.1% de solución de SDS sobre la membrana y agitar suavemente durante unos minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Enjuague por lo menos en 250 ml de agua estéril 100 mM Tris pH 8 durante al menos 10 min.
Envuelva la membrana en SaranWrap y los bordes de cerrar cuidadosamente con cintas. Almacenar a 4 ° C. (Membranas nunca debe secarse.)

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Discussion

El procedimiento de extracción no ha sido optimizado. Sin embargo, el procedimiento de agotamiento dado en las instrucciones del fabricante (2 lavados cada 10 min en etanol al 100%, un lavado de 1 hora a 60 ° C en el 0,5% SDS) es insuficiente. Por lo menos una noche de incubación en el 100% de etanol es necesario para disolver el producto de reacción ECF; de incubación de varios días en el 100% de etanol no parece tener efectos adversos sobre la capacidad de sondear la membrana. Tratamiento del fabricante SDS también parece ser insuficiente. Newcastle ha tratado de 1 hora a 80 ° C con 0,5% SDS seguido de un tratamiento con cerca de ebullición 0,1% SDS con éxito. Tracy ha demostrado que una vez más con-vierte cerca de ebullición SDS 0,1% es suficiente.

Consejos útiles:
El tampón de hibridación, el tubo de hibridación y la solución de lavado principal debe ser precalentado a 60 ° C antes de su uso, y debe mantenerse a esa temperatura durante todo el experimento. Por ejemplo, mantener los topes en una placa calefactora con un termómetro sumergido, en una placa de calefacción de Corning, un valor de alrededor de 3 resultados en 60 ° C.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685