Biology

Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/201

Vinh D. Pham¹, Tsultrim Palden¹, Edward F. DeLong¹

¹Division of Biological Engineering, Department of Civil and Environmental Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Summary

Abstract

Metagenomic bibliotek arkivera stora fragment av sammanhängande genomisk sekvenser från mikroorganismer utan föregående odling. Generera ett standardförfarande för att skapa och screening metagenomic biblioteken är därför lämpligt för effektiv hög genomströmning undersökningar av genetiska och metaboliska egenskaper okultiverade mikrobiell konstellationer. Här är viktiga protokoll presenteras på video, som vi föreslår är den mest användbara format för exakt beskriva en lång process som växelvis beroende av robotar instrumentering och (mänskliga) ingrepp manual. Först anställde vi robotik att upptäcka biblioteket kloner på hög densitet macroarray membran, som alla kan innehålla dubbletter kolonier 20-4 384-såväl bibliotek plattor. Automation är nödvändigt för detta förfarande inte bara för noggrannhet och hastighet, men också på grund av miniatyrisering av omfattning som krävs för att passa det stora antalet bibliotek kloner till mycket tät rumsliga arrangemang. När genererade visade vi nästa hur macroarray membranen kan screenas för gener av intresse att använda modifierade versioner av standardprotokoll för givare märkning, membran hybridisering, och signal upptäckt. Vi kompletterade den visuella demonstration av dessa förfaranden med detaljerade skriftliga beskrivningar av de inblandade steg och nödvändigt material, som alla finns tillgängliga online tillsammans med video.

Protocol

1. Hybridisering förfarande

En hybridisering röret kommer att ta 1 eller 2 membran (storlek 22 med 22 cm). Använd 50 ml av hybridisering blandningen och 0,5 mg av DNA-probe (10 ng / ml slutkoncentration) per hybridisering rör. För bästa resultat, använd gel-renat DNA som proben. Om skala upp sonden förberedelse, öka antal rör snarare än att öka mängden reagens per rör.

Probe förberedelse (0,5 mg DNA):

Späd 15 l av gränsöverskridande länkare lösning med 60 l vatten.
Späd DNA till 10 ng / l med vatten till 50 l totala volymen i en skruvkork mikrorör.
Denaturera DNA i 5 minuter i kokande vatten.
Snabbt överföra till is och låt svalna i 5 minuter. Spin kort.
Tillsätt 50 l av reaktion buffert och blanda försiktigt.
Tillsätt 10 ìl märkning reagens och blanda försiktigt.
Tillsätt 50 l av den utspädda cross-linker-lösning från steg 1 och blanda försiktigt. Vortex försiktigt och spin kort.
Inkubera vid 37 ° C i 30 min.
Håll på is för upp till 2 timmar eller lägga till en lika stor volym 100% glycerol och förvara vid -20 ° C.

Observera: Använd vatten som levereras med satsen. Förvara alla reagenser på is om inte annat anges.

Membran beredning och hybridisering

Värm 50 ml av hybridisering buffert och hybridisering röret till 60 ° C.
Lägg till hybridisering bufferten till hybridisering röret. Kavla upp membran (er) och lägga till hybridisering rör. (Om du lägger två membran per rör, först rulla upp ett membran helt, sedan rulla upp den andra membranet på topp i samma riktning.)
Inkubera hybridisering rör vid 60 ° C i minst ½ h. (Se till membran (s) blir blöt ordentligt.)
Överför ca 1 ml av hybridisering buffert med en lång pipett ur hybridisering röret till röret med den märkta sonden. Vortex försiktigt och spin kort. Överför blandningen till hybridisering rör.
Inkubera vid 60 ° C över natten.

Obs: Använd en pincett och handskar vid hantering av membran. Blanda innehållet i hybridisering rör försiktigt eftersom för mycket upprördhet kommer att orsaka permanent bildning av oönskade skum. Membran bör läggas i vått tillstånd, blöt i hybridisering buffert eller vatten om det behövs och dränera bort överflödig vätska innan du lägger till.

2. Upptäckt förfarande

Tvätt membran

Värm primära tvättningsbuffert till 60 ° C. (Använd mikrovågsugn och / eller värmeplatta.)
Om det finns två membran i en hybridisering rör, överföra ett membran till en ren, förvärmd, tomma hybridisering rör.
Kortfattat skölj hybridisering rör med ca 50 ml av den primära tvättbuffert.
Tillsätt ca 100 ml av den primära tvättbuffert hybridisering rör och inkubera vid 60 ° C i 10 min.
Upprepa steg 3 och 4.
Överföring membran att tvätta behållare och inkubera med minst 250 ml sekundärt tvättbuffert i rumstemperatur i 5 minuter.
Upprepa steg 6.

Obs: Membranes får hållas i den sekundära tvättbufferten i rumstemperatur i upp till ½ h innan signalen generation.

Signal generation och detektion (förfarande för ett membran)

Tejpa två bitar SaranWrap platt på bordet (en för steg 2 och en för steg 4).
Försiktigt dränera bort överflödig buffert från membranet genom att röra vid hörnen av membranet mot sidan av behållaren och för över membranet på SaranWrap (urval uppåt).
Häll 6-7 ml av ECF reagens över membranet och vik Saran svepa över membranet. Noggrant distribuera ECF reagens över membran genom att försiktigt flytta en Kimwipe över SaranWrap. Inkubera i 5 minuter.
Tappa av överflödigt ECF reagens från membranet och överföra den på nytt SaranWrap, fäll svepa över membranet, och försegla kanterna med tejp. Täck membranet med aluminiumfolie. Inkubera i 1-2 timmar.
Förbered plattan skannerglaset genom att distribuera 1-2 ml ECF reagens under glasskivan. Sedan överföra membranet på glasplatta (urval nedåt) och distribuera ytterligare 1-2 ml av ECF reagens över membranet. Overlay med SaranWrap och försiktigt skjuta alla luftbubblor bort från membranet. (Du kan placera en styv platta ovanpå SaranWrap att hålla membranet pressas mot glasskivan.)
Använd Fuji FLA-5100 fluorescens scanner ("en laser en bild"-läge) med följande inställningar: excitation 473 nm, upptäckt filter LPB (510 nm), upplösning 50 ìm, 16-bitars signal examen, CH1 400 V. (Scan tar ca 15-20 min per membran av storlek 22 med 22 cm.)

Tillval:
Låt sitta i 2-4 timmar (eller längre).
Upprepa sökningen som i steg 6.

3. Strippning och lagring förfarande (NUF version)

Överför membran till 100% ethanol och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter under försiktig omrörning.
Ersätt med färska 100% etanol och inkubera över natten i rumstemperatur. (Membran kan finnas kvar i etanol i flera dagar.)
Byt ut etanol med destillerat vatten och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
Tillsätt 100 ml vatten och 5 ml 10% SDS (sista 0,5% SDS) till en hybridisering röret och blanda försiktigt. Lägg membran.
Inkubera vid 80 ° C under 1 h.
Överför membran till en ren, tom behållare.
Tillsätt 500 ml vatten och 5 ml 10% SDS (sista 0,1% SDS) en bägare och värme till en kraftfull koka i mikrovågsugnen.
Häll den nästan kokar 0,1% SDS-lösning över membranet och skaka försiktigt i flera minuter. Låt svalna till rumstemperatur.
Skölj i minst 250 ml steril 100 mM Tris pH 8 i minst 10 min.
Wrap membran i SaranWrap och omsorgsfullt nära kanterna med band. Förvaras vid 4 ° C. (Membran får aldrig torka ut.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det strippa förfarandet inte har optimerats. Dock är strippa förfarande som anges i tillverkarens anvisningar (2 tvättar vardera 10 min i 100% etanol, 1 tvätta av 1 h vid 60 ° C i 0,5% SDS) otillräcklig. Åtminstone natten inkubation i 100% etanol är nödvändigt för att lösa upp produkten ECF reaktionen, flera dagars inkubation i 100% etanol verkar ha några negativa effekter på förmågan att reprobe membranet. Tillverkarens SDS behandling verkar också vara otillräcklig. NUF har försökt 1 timme vid 80 ° C med 0,5% SDS följt av en behandling med nästan kokande 0,1% SDS med framgång. Tracy har visat att en gång hälla-över med nästan kokande 0,1% SDS är tillräckligt.

Hjälpsamma tips:
Den hybridisering buffert, hybridisering rör, och primära tvättbuffert måste förvärmas till 60 ° C före användning, och måste hållas vid den temperaturen under hela försöksperioden. Till exempel hålla buffertar på en värmeplatta med en nedsänkt termometer, på ett Corning värmeplatta, en inställning på ca 3 resulterar i 60 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685