Summary
Het isoleren van volwassen stamcellen uit spier-en zachte weefsels op basis van de cel naleving snelheid kolf.
Abstract
Volwassen stamcellen zijn al lang besproken met betrekking tot de toepassing ervan in regeneratieve geneeskunde. Volwassen stamcellen hebben geleid tot een veel opwinding voor de behandeling van gewonde en zieke weefsels als gevolg van hun indrukwekkende mogelijkheden om multi-lijn celdifferentiatie en hun zelf-vernieuwing kunnen ondergaan. Het belangrijkste is, hebben deze eigenschappen hen voordelig voor gebruik in de autologe stamceltransplantatie therapieën. Het huidige protocol zal introduceren de lezers op de gewijzigde preplate techniek waarbij zachte weefsels van het bewegingsapparaat, zoals pees-en spier, zijn een
Protocol
In het algemeen, de complete gewijzigde preplate procedure vereist 1-2 dagen van voorbereiding, 1 week van het uitvoeren van de technische procedure, 2-3 dagen van cel identificatie met immunocytochemie, en een extra 2-3 weken van stamcel populatie expansie. De apparatuur die nodig is voor stamcellen cultuur zijn vergelijkbaar met die van andere celkweek systemen die een bench-top centrifuge, CO 2 incubator, Laminaire stroming weefselkweek kap en een omgekeerde microscoop uitgerust met fluorescentie en een digitale camera bevat. De geïsoleerde stamcellen ook gekloond kunnen worden en kunnen opgeslagen worden op lange termijn in vloeibare stikstof voor de huidige of toekomstige studies 1,2. Alle reagentia en materialen die worden gebruikt voor deze procedure moet steriel en aseptisch behandeld.
Stap 1: Voorbereiding
- Collageen vacht weefselkweek gerechten en flacons: Type I collageen afgeleid van kalf huid (0,1 g in 1 liter, Sigma-Aldrich). De plasticware de vacht bestaat uit: T-25 flessen, 6 of 12 goed borden, schalen (60 en 100 mm, BD Falcon) zoals eerder beschreven 1,2. Schud de plasticware elk half uur, gedurende 4 uur om zelfs coating van het collageen te verzekeren. Het collageen oplossing wordt dan verwijderd. En de gecoate plasticware wordt vervolgens drogen in de weefselkweek kap met het UV-licht en de kap zowel op, om de steriliteit te waarborgen, en tot slot vatte of bedekt voor later gebruik.
- Bereid celkweekmedium: 400ml DMEM (DMEM, hoge glucose, Invitrogen), 50ml warmte geïnactiveerd foetaal Bovine Serum (FBS, Invitrogen), 50ml Horse Serum (HS, Invitrogen), en 5 ml Chick Embryo Extract (CEE; Accurate Chemical Co ) zal vacuüm gefilterd met behulp van een disposable 0.22-um van 500 ml steriele filter-systeem (Corning) zijn. Steriele penicilline / streptomycine-oplossing (Invitrogen) zullen worden toegevoegd uiteindelijk 100 Eenheden / ml. De bereide oplossingen kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste een maand. Deze oplossing wordt gebruikt om de cellen van de fles los te maken bij het splitsen van culturen, of de voorbereiding van de cellen voor transplantatie.
- Warm-up oplossingen voor celisolatie: De volgende reagentia dienen te worden opgewarmd tot 37 ° C voorafgaand aan het gebruik ervan voor celisolatie: Buffered Salt Hank's Solution (HBSS, Invitrogen), 0,2% (wt / vol) collagenase-type XI (Sigma -Aldrich), met een gemiddelde van 3.200 collageen vertering eenheden per ml HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) trypsine (Invitrogen).
- Steriliseer chirurgische apparatuur in voorbereiding: Chirurgische procedure vereisen steriele chirurgische instrumenten, waaronder: verschillende groottes tang, micro-schaar, iris schaar en / of scalpel mesjes. Bovendien, 15 en 50 ml polypropyleen centrifugebuis (BD Falcon), Cell zeef (poriegrootte 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - en 27-gauge naalden (BD PrecisionGlide), en 10 - of 20-ml steriele spuiten (BD).
Stap 2: weefselbiopten, isolatie en mechanische dissociatie 1-4
Het weefsel biopsies worden uitgevoerd onder een steriele cultuur motorkap en onder andere vers geoogst pezen en skeletspieren worden verkregen uit de tibia of soleus spieren van de achterbeen van de wild-type muizen (Vrouw C57BL/6J, 4-5 weken of jonger, Jackson laboratorium). Enige zichtbare bindweefsel, bloedvaten en vetweefsel worden vervolgens verwijderd uit de biopsie monsters. De weefsels van de pees en spieren zijn dan voorzichtig die in het kader van een chirurgische dissectie microscoop om de overblijfselen van de huid en de botten te verwijderen en geplaatst in een schotel met koud (4 ° C) HBSS (aangevuld met add 5% van FBS). De geïsoleerde weefsels worden dan afzonderlijk geplaatst op collageen gecoate platen met koud HBSS en zal worden gehakt (<1x1 mm 3) in een grove brij met behulp van micro-schaar en / of scalpel mesjes.
Stap 3: Enzymatische vertering van het weefsel:
Het gehakt weefsel wordt vervolgens enzymatisch gedissocieerd door een reeks van stappen 2,4,5
- Breng het gehakt weefsel slurries in afzonderlijke 15-ml buizen en centrifugeer bij ~ 3500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, wassen met HBSS en herhaal het centrifugeren.
- Verwijder het supernatant en verteren deze slurries door het toevoegen van 10 ml voorverwarmd 0,2% collagenase-type XI (Sigma). Incubeer 60 minuten bij 37 ° C, terwijl continu zachtjes de buizen schommelen. Als alternatief, schud met de hand om de 10 minuten.
- Centrifuge en resuspendeer deze slurries in 10 ml dispase (2,4 eenheden / ml, Gibco) oplossing. Incubeer 45 minuten bij 37 ° C, schudden met handen of het zachtjes schommelen elke 10 minuten.
- Centrifuge en resuspendeer deze slurry in 10 ml van 0,2% trypsine HBSS oplossing. Incubatie is afhankelijk van de mate waarin de afzonderlijke cellen vrijkomen uit de weefsels die kan worden uitgevoerd door het observeren van de opschorting onder de microscoop. Het is niet aan te bevelen 30 minuten dan bij 37 ° C met het omkeren van de buizen of zachtjes wiegen elke 10 minuten.
- Centrifugeer de resulterende cels en resuspendeer de cel pellet in 10 ml van de Proliferatie Medium (PM).
- Distantiëren van de celsuspensie door het passeren van het extract door een reeks naalden. De cellen worden vervolgens twee keer door een 18G, dan een 23G, en tenslotte een 27G naald.
- Passeren de cel extract door een 70-um cel zeef.
Stap 4: Preplating naar verschillende celpopulaties op basis van celadhesie rate 1-3 te isoleren
- Centrifugeer en resuspendeer de cel pellets in proliferatie Medium.
- Het bord van de cel mengsels op een collageen gecoate T-25 vat (of 60 mm schaal) en markeer deze als PP1. De cel suspensie moet in acht worden genomen als het bezit van een groot aantal van refractieve kernen en ander vuil onder de microscoop.
- Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde, 5% CO 2 incubator gedurende 2 uur.
- Overdracht klevend cellen om een nieuw collageen gecoate T-25 vat (of 60 mm gerecht) en merk is als PP2. Voeg 5 ml van PM in de plaat label PP1. De vroege hechtende cellen die hechten aan de kolf zijn meestal myofibroblasten 3.
- Zet de kolven om de incubator voor nog eens 24 uur, transfer klevend cellen om een nieuw collageen gecoate T-25 kolf (of gerecht) en het als PP3 markeren. Voeg 5 ml van de proliferatie Medium op de plaat label PP2. Deze hechtende cellen die hechten aan deze kolf zijn meestal fibroblasten 2,3.
- Keer terug naar de incubator kolven en herhaal de procedure in een ander 24 uur tot de bevolking PP6 wordt gemaakt. Handhaaf elke groep van zwevende cellen en hen in staat stellen zich te verspreiden en het onderzoek regelmatig met een omgekeerde microscoop. PP3-PP4 zijn meestal myoblasten terwijl de spier een satelliet-cellen worden vaak vooral gezien in PP5 2.
- Het grootste deel van de langzaam hechtende cellen meestal hechten door PP6. In dit stadium, de cellen lijken kleine, ronde, licht refractieve en zijn zeer schaars in aantal en worden beschouwd als een stamcel populatie 1,2 is.
Stap 5: Identificatie en uitbreiding van geïsoleerde stamcellen
- De geïsoleerde PP6 cellen zijn zeer gering in aantal en moeten worden gehandhaafd in FBS rijke Proliferatie Medium (20% FBS in DMEM) die dagelijks wordt veranderd. Het grootste deel van de cellen aanwezig zijn in het PP6 cultuur sterven tijdens de volgende 1-2 weken van het kweken, maar een grote, gezonde PP6 bevolking is meestal gemaakt na een extra 1-2 weken van de expansie. De stamcellen geïsoleerd uit muizen zeer uitdrukkelijke stamcel antigeen 1 (Sca1), CD34, foetale lever kinase 1 (Flk1), en andere stam markers 1,2,6,7 die kunnen worden gevisualiseerd via immunocytochemische vlekken. Deze stamcellen vertonen ook meerdere differentiatie capaciteiten 3,6,8.
- De geïsoleerde cellen worden onderhouden en uitgebreid op een laag celdichtheid in cultuur (12-gerechten goed bij 50-100 cellen / putje of <20-30% confluentie in de kolf of schotel) tot differentiatie 1,2 voorkomen. Zeer weinig cellen vormen klonen tijdens de expansie, en deze gekloonde stamcellen kunnen lange tijd proliferatie (LTP) ondergaan voor een andere competentie studies. De gekloonde stamcellen ook kan opslaan in vloeibare stikstof met behulp van algemene cel opslag procedures worden bijvoorbeeld PM medium met 10% DMSO. Maak een aantal lage passage voorraden van de stamcellen voor enig ander back-up studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is bekend dat sommige volwassen weefsels meerdere stamcellen bevatten. In de afgelopen jaren van studie, zijn stamcellen aangetroffen in de zachte musculoskeletale weefsels, waaronder skeletspier en pezen. Deze huidige protocol details een procedure, die bekend staat als de gewijzigde preplate techniek, die met succes is gebruikt in ons laboratorium om volwassen stamcellen uit pezen en skeletspieren te isoleren. Met behulp van de gewijzigde preplate beschreven techniek boven de cellen kunnen worden onderverdeeld in verschillende bevolkingsgroepen op basis van hun adhesie eigenschappen collageen gecoate kolven (figuur 1). Fibroblasten en myofibroblasten te vinden in de weefsels snel hechten aan het collageen gecoate kolven binnen 24-48 uur en worden in eerste instantie gescheiden van andere cellen in PP1-PP2. De myogene of endotheelcellen zich te houden aan collageen gecoate kolven na een langere periode, binnen 48-96 uur (PP3-PP5), en kunnen worden geoogst en geïdentificeerd door hun celoppervlak markers. De latere preplated cellen, 96 uur of later (PP6), worden beschouwd als volwassen stamcellen (Figuur 2). De late preplate cellen lijken klein, rond, en doorschijnend aan het begin van hun isolement en kunnen verder worden gekarakteriseerd door flowcytometrie of immunocytochemie voor hun expressie van stamcel antigeen 1 (Sca1), CD34, foetale lever kinase 1 (Flk1), en andere stamcellen markers (figuur 3). De geïsoleerde stamcellen hebben het vermogen tot zelf-vernieuwing en experimentele studies hebben hun multipotent aangetoond aan de hand van hun differentiatie in de drie kiembladen: mesoderm, ectoderm, endoderm en 9. Meerdere onderzoeken hebben ook aangetoond dat deze stamcellen differentiëren tot cellen van het mesoderm geslacht inclusief osteocyten, adipocyten, chondrocyten, en hematopoietische cellen 6,8. Andere studies hebben aangetoond dat de volwassen stamcellen in ectoderm cellijnen onderscheiden door hun expressie van neuronale en gliale cel markers en hun vermogen om ledematen functie te verbeteren na de perifere zenuw beschadigd is 10. Deze geïsoleerde adulte stamcellen zijn gunstig voor het herstellen van gewonde en zieke musculoskeletale weefsels, en andere gerelateerde in-vivo studies zijn uitgevoerd op andere weefsels waaronder hart, lever, en het ruggenmerg en specifieke medische aandoeningen zoals dunne darm submucosa en de blaas te behandelen stress-urine-incontinentie 9.
Figuur 1.
Figuur 2.
Figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs zijn zeer erkentelijk voor mevrouw Haiying Pan en de heer Ian Bellayr voor hun technische hulp op celisolatie voor de huidige films en de heer Kyle Holden en de heer Jonathan Lucas voor hun hulp op dia bewerken. Veel dank aan de volgende lijst van personen die betrokken zijn geweest bij de ontwikkeling van de gewijzigde preplate technieken die de afgelopen jaren: Drs. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. We zijn dankbaar voor de technische bijstand van James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan en Jessica Tebbets. De auteur zou ook graag de financiële steun voor dit werk erkennen van de spierdystrofie Association (MDA), de National Institutes of Health (NIH), het Department of Defense (DOD), van de Children's Hospital van Pittsburgh van UPMC, het Ministerie van orthopedische chirurgie, en de Universiteit van Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
