Summary
Tidig embryonal lunga orgel kulturen är ett mycket användbart system för att studera epiteliala-mesenkymala interaktioner. Både epiteliala och mesenkymala morfogenes intäkter under särskilda förhållanden som lätt kan manipuleras i detta system.
Abstract
Lung ursprungliga specifikationen samt förgrening morfogenes, och bildandet av olika pulmonell cell linjer kräver en viss interaktion i lungan endoderm med omgivande mesenkym och mesothelium. Lung mesenkym har visat sig vara källan till induktiva signaler för lung förgrening morfogenes. Epitelial-mesenkymala-mesothelial interaktioner är också kritiska till embryonala lunga morfogenes. Tidig embryonal lunga orgel kulturen är ett mycket användbart system för att studera epiteliala-mesenkymala interaktioner. Både epiteliala och mesenkymala morfogenes intäkter under särskilda förhållanden som lätt kan manipuleras på detta system (i avsaknad av moderns inflytande och blodflöde). Ännu viktigare är denna teknik kan lätt göras i en serumless, kemiskt definierade kultur media. Vinst och förlust av funktion kan uppnås genom uttryckta proteinerna, rekombinanta, virala vektorer och / eller analys av transgena musstammar, antisense-RNA, samt RNA-interferens gen knockdown.
Protocol
Organ kultur är en mycket användbar och mångsidig teknik för att studera gen-och proteinuttryck. Dessa ex vivo kultur metoder kan användas som preliminära eller komplement till in vivo-studier.
1. Embryonala Lung Isolering
- Begränsad-gravida möss offras på postcoitum dag 11,5 eller 12,5 (E11.5-12,5) av CO 2 narkos enligt NIH och OLAW riktlinjer. Djuret placeras i en kammare och 100% CO 2 införs. Efter att djuret är medvetslöst CO 2-flödet ökar. Kliniska avliva djuret måste säkerställas.
- Alla följande steg måste slutföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. Livmodern tas bort från gravida kvinnor. För att ta bort livmodern på djuret, är dräktiga honor placeras på deras rygg och besprutas med 70% etanol. Ett snitt görs i buken, och huden tas bort genom att dra huden uppåt medan du håller i djurets bakben. Bukhålan öppnas och livmodern tas bort från djuret.
- Blodet sköljs bort genom att placera i livmodern i en 50 ml koniska rör fyllt med kallt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), och röret försiktigt gungade i 2 minuter.
- Livmodern är sedan placeras i en petriskål under stereoskopiska dissekera mikroskop, och embryona frigörs från livmodern genom öppning av livmoderväggen med Spring sax. Embryona skördas med en perforerad sked, och placeras på is i en ny petriskål innehåller HBSS.
- Enligt den stereoskopiska dissekera mikroskop, är embryonala lungor dissekeras en efter en i en petriskål med kallt HBSS (Figur 1).
- De isolerade embryonala lungan läggs på is i en petriskål med HBSS med en steril överföringspipett.
2. Embryonala Lung Kultur
- 500 mikroliter till 1 milliliter per brunn av D-MEM/F-12 kompletteras med 50 enheter / ml penicillin, streptomycin läggs i en Nunclon Polystyren maträtt.
- En Nuclepore Polykarbonat Track-Etch membran är placerad på toppen av media. När Nuclepore Polykarbonat Track-Etch membran är placerad på toppen av media, se till att den blanka sidan är mot media, och grova sidan är vänd uppåt.
- En dissekerade embryonala lunga är placerad på toppen av Nuclepore Polykarbonat Track-Etch Membran med en steril överföringspipett.
- Den embryonala lungan läge justeras med hjälp av pincetten. Embryonala lunga placeras på filtret ska ha en intakt luftstrupe och placeras med sin luftstrupen ha en rak position, så att alla lungorna har samma inre tryck.
- Den Nunclon Polystyren maträtt överförs till den önskade kulturen tiden i en cell inkubator (figur 2).
3. Material
1. Embryonala Hela Lung Isolering
- Begränsad-gravida (C57BL6 vildtyp eller transgena) möss som ska offras på postcoitum dag från 11,5 till 13,5 (E11.5-13,5).
- Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), flytande, utan kalciumklorid, magnesiumklorid, eller magnesiumsulfat. (Invitrogen, Carlsbad, CA) kompletterat med 50 enheter / ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Förvara HBSS vid rumstemperatur och vid 4 ° C efter öppnandet. Alikvotera och lagra Penicillin-streptomycin vid -20 ° C.
- Stereoskopiska dissekera mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland).
- Dissection verktyg inklusive Dumont pincett, Fine iris sax (raka), Noyes våren sax och Moria ® sked (perforerade) (Fine Science Tools, Foster City, CA).
2. Embryonala Hela Lung Kultur
- Dulbecco ändrade Eagle Medium: Nutrient Blanda F-12 (D-MEM/F-12) (1X), flytande, Innehåller 01:01 L-glutamin, men ingen HEPES buffert. (Invitrogen, Carlsbad, CA) kompletterat med 50 enheter / ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Håll DMEM/F-12 flaskan bort från ljus (t.ex. omfattas av aluminiumfolie) och förvara vid 4 ° C. Alikvotera och lagra Penicillin-streptomycin vid -20 ° C.
- Nuclepore Polykarbonat Track-Etch Membran, 8,0 m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membran (Whatman, Florham Park, NJ).
- Nunclon Polystyren skålen med lock, 4 brunnar (Rochester, NY).
- Disponibel överföringspipetter, sterila (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Figur 1. Dissekering av E12 embryonala lungorna. (A) E12.5 hela embryo sett från höger sida. (B) Rätt forelimb har tagits bort från embryot. (C) Tång som innehas av den vänstra handen håller embryot stadigt i skålen. Pilarna anger plan dissektion (D) Embryonala lung ligger posteriort om hjärtat (bort) Och främre till ryggraden. Bilden visar lungorna efter hud och hjärta borttagning. (E) Svalget borttagning gör separation av intakta lungan från embryot. (F) Främmande farynx vävnad och matstrupe har trimmas bort. Dissekerade E12.5 embryonala lunga med intakt luftstrupen och struphuvudet visas. (Cr) Kranial lob, (Med) Medial lob, (Ca) caudal lob, (ACC) Tillbehör lob, (Le) vänster lob.
Figur 2. FGF9 inducerar expansion av mesenkym och utvidgning av epitel i lunga vuxit in vitro. (AC) E12.5 lungan odlas för 48 timmar i frånvaro av FGF9. Notera ökningen av förgrening. (DF) E12.5 lunga som odlas för 48 timmar i närvaro av FGF9. Notera utvidgning av epitel och mesenkym så tidigt som efter 24 timmars kultur (E). Efter 48 timmar (F), är effekten på epitelet ännu mer uttalad. Skala bar: AF 400 ìm 4.
Den fullständiga texten protokollet för denna experimentella strategi finns i Springer protokoll .
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Saban Research Institute doktorander Award (PMDM), och genom NIH RO1 HL75773 (DW).
References
- Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
- Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
- Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
- Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
- Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
- Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).
