في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

Summary

نحن تصف تقنية microinjecting للأمينوغليكوزيد ، جنتاميسين ، في 2 يوما بعد fetilization (DPF) يرقات الزرد للحث على اصابة الكلى الحاد (AKI). نحن تصف أيضا طريقة لتحميل كامل المناعية ، والبلاستيك ، وتضمين sectioning اليرقات الزرد لتصور الضرر بوساطة AKI.

Abstract

في هذه المقالة الفيديو وصفنا نموذج من الزرد آكي استخدام الجنتاميسين كما nephrotoxicant. تقنية تتكون من microinjections عن طريق الوريد على الزرد DPF 2. هذه التقنية تمثل وسيلة فعالة وسريعة لتوصيل مواد قابلة للذوبان في مجرى الدم من اليرقات الزرد ، والسماح للحقن الأسماك 15-20 ساعة. بالإضافة إلى دراسات AKI ، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية microinjection استخدامها لأنواع أخرى من الدراسات التجريبية مثل القسطرة. ونحن نقدم بروتوكول مفصل للتقنية من المعدات اللازمة لتدابير البصرية وظائف الكلى ينخفض. بالإضافة إلى ذلك ، علينا أن نظهر أيضا عملية ، تثبيت المناعية جبل بأكمله مع الكلى علامة أنبوبية ، وتضمين البلاستيك sectioning من الزرد اليرقات. علينا أن نظهر أن اليرقات الزرد حقنوا الجنتاميسين تظهر ملامح شكلية تتفق مع آكي : وذمة ، وفقدان الاستقطاب الخلية في الخلايا الظهارية الأنبوبية الداني ، والتعطيل المورفولوجية للنبيب.

Protocol

ويستند جزء من بروتوكول التالي على نشر أساليب ذكرت من قبل (Hentschel وآخرون 2005) و (اينشتاين وآخرون 1995) مع تعديلات طفيفة.

الجزء 1 : Microinjections

إعداد مقدما لmicroinjection

• يتم حقن هذه الأسماك في 2 يوما بعد الإخصاب (DPF). ولذلك ، فهي تربى الزرد الكبار قبل 3 ليال لتجربة كان مقررا. جمع الأجنة ووضعها في صحن بيتري بالماء E3 (كلوريد الصوديوم 5mm ، و 0.17mM بوكل ، 0.33mM CaCl ₂ ، 0.33mM MgSO ₄₎ في 28.5 درجة مئوية. في نهاية اليوم الأول إزالة الأجنة الميتة من طبق بيتري والأجنة منفصلة بحيث يكون هناك 8-10 الأجنة في طبق بتري.
• تعد الإبر الزجاج سحب من الأنابيب الشعرية (4 بوصات في الطول ، 0.63 / 0.20 OD / ID المليمتر (ملم) R - 6 أنابيب الزجاج مخصص دروموند العلمية الشركة ، Broomall ، والسلطة الفلسطينية 9-000-3000) مع مجتذب الكهربائي. وينبغي أن يكون القطر غيض من 10-20 ميكرون. تشريح تحت المجهر (لايكا S6E) ، مع رسم علامة دائمة ما يقرب من 10 خطوط 1MM على طول الإبرة ، مع مساعدة من الحاكم ، وتخزين الإبر في طبق بتري كبير على سلالم الطين.
• إعداد ماصة في الانتظار : حريق تلميع غيض من رقيقة الجدران أنبوب زجاجي البورسليكات الشعرية (152 ملم ، 1 / ​​0.75 OD / ID ملم TW100 - 6 ، الآلات الدقيقة العالمي ، وشركة) في بنسن لهب الموقد حتى قطرها الداخلي غيض من 0،4-0،5 مم. البعد من هذا القبيل يسمح لقبضة جيدة من كيس المح ليرقات DPF الزرد 2. عقد واحدة من نهاية قطعة من الزجاج باستخدام الملقط الشعرية الطويلة ، والحرارة طرف نقيض مع من شعري مع الموقد بنسن ، وضعه عموديا على مخروط الضوء الأزرق الداخلية للشعلة ، وسخونة جزء منه ، لمدة 1-2 ثوان ، المتداول إلى الحصول على تذوب حتى. كرر ذلك عدة مرات ثم تفحص تحت المجهر الشعرية ، على مرحلة ميكرومتر (وارد 94 W 9910). هذا هو خطوة حاسمة ، قد يكون من الضروري إطلاق النار البولندية ماصات عقد قليلة وتحديد الحجم المناسب في وقت لاحق ، في حين كنت التلاعب اليرقات. إذا كنت حذرا ، واحد ماصة عقد يستمر لمدة microinjection دورات متعددة.
• شغل مضخة Microsyringe يدوي (MMP ، عالم الآلات الدقيقة ، وشركة) مع الزيوت المعدنية ، وبعد أن التعليمات الصادرة من قبل الشركة المصنعة. يتم إدراج حامل ماصة في عصا التحكم مناور (Narishige ، MN - 151) ، متصلا مع موقف المغناطيسي (Narishige ، MN 151) على صفيحة الحديد (Narishige ، IP).

Microinjection

• إعداد 20μl من خليط الحقن : 2.4μl جنتاميسين (سيغما الدريخ G8648 ، 50mg/ml في محلول ملحي) و17.6μl 10 كيلو دالتون لوسيفر الصفراء ديكستران (Invitrogen D1825 (1mg/ml في محلول ملحي) في السيطرة على الأسماك يتم استبدال جنتاميسين بمحلول ملحي ، وديكستران فلوري (ويمكن استخدام ألوان مختلفة كثيرة) غير كافية للتحقق من دقة وحدد حقن اليرقات التي تم حقنها مع nephrotoxicant.
• 2 30mm إعداد أطباق بتري مع الزيوت المعدنية 2ml لوضع خليط ومزيج الحقن تحت السيطرة ، لمنع التبخر من الحلول.
• إعداد مخدر : 400 ملغ tricaine مسحوق (إيثيل - M - أمينوبنزوات methanesulfonate SIGMA A - 5040) 97.7 مل ماء DD ، 2.1 مل 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 9). التكيف مع درجة الحموضة 7. هذا الحل تخزين المخزون في الثلاجة ، في aliquots من 4.2 مل. لاستخدام tricaine كمخدر تمييع الأسهم tricaine 4.2 مل حل في 100 مل من الماء E3 (Westerfield 1993) وترك في درجة حرارة الغرفة.

يتم تنفيذ الخطوات التالية تحت مجهر تشريح

• يدويا إزالة أي chorions المتبقية مع ملقط وغرامة تخدير الزرد نقلهم في طبق بيتري مع tricaine تحسنت في درجة حرارة الغرفة. وينبغي أن يتعرض لالزرد tricaine 15 دقيقة على الأقل قبل بدء microinjections.
• فتح غيض من إبرة الحقن باستخدام شفرة حلاقة (VWR العلمية 55411-050). عقد نصل في زاوية طفيف لإنشاء شطبة وقطع رأس مثل الحصول على افتتاح قمة بقطر حوالي 10 20μm.
• بدوره على فراغ ، والقوة والإمداد الجوي للجهاز microinjection (البنك الدقة الصكوك ، وشركة PV820 picopump الهوائية). ادخال الإبرة في ماسك إبرة مثبتة على قاعدة micromanipulator وإمالة (الآلات الدقيقة وورد ، شركة ، الموديل M3301R والسل - 1).
• لشغل الإبرة ، وضع قطرة (10μl) من حل ليتم حقنه في طبق بتري 30mm مليئة الزيوت المعدنية (فيشر كيماويات ، 0121-1). تحويل micromanipulator دليل حتى غمر رأس الإبرة في قطرة من الحل ، وتعيين picopump "عقد / تنفيس" التحول الى "تنفيس" ("تنفيس" يعادل الفراغ على PV820) ، وشغل الإبرة عن طريق سحب الحل في طريق طرف الإبرة. وسوف يستغرق ذلك بضع دقائق ، إذا كان هذا الحل يدخل الإبرة سريع جدا ،هذا يعني أن القطر من طرف كبير جدا ، والحقن لن تكون دقيقة. تعيين picopump إلى "عقد" ("عقد" لحقن يعادل على PV820) بعد شغل الإبرة.
• لمعايرة الإبرة ، تعيين picopump "بوابات / موقوتة" التحول إلى "بوابات" ، اضغط على دواسة القدم لتصريف الإبرة ، وتسجيل الوقت الذي يستغرقه (ثانية) لهلالة للسفر من واحد إلى وسم 1 (المقبل المسافة الإجمالية ملم). كرر 3 مرات ، تأخذ من الوقت المتوسط ​​(في ثوان) ، وتقسيم القيمة 30 (وحدة التخزين في nanoliters (NL) المقابلة للمسافة 1 ملم الخطية) لتحديد عدد من ميلي ثانية المطلوب لتسليم 1 NL من الحل. ضبط مقبض فترة تتراوح إلى هذا الرقم ، ونقل "بوابات / موقوتة" التبديل إلى "توقيت". الآن تم تعيين picopump لتسليم نبض 1nl من الحل.
• إزالة الطبق الزيوت المعدنية وموقف طبق بيتري مع اليرقات تحت المجهر. المجموعة السمك في وسط الطبق بيتري والتركيز.
• ضع ماصة عقد في مضخة microsyringe اليدوية (MMP ، وأدوات الدقة العالمي) على الجانب الآخر من microinjector ، مقدما طرفها إلى طبق بيتري ، وإلى الطائرة التي تركز عليها المجهر. ثنيه بزاوية ضحلة نسبيا ، بحيث غيض جدا ماصة للعقد هو لمس الجزء السفلي من طبق بيتري ، وعلى مقربة من الأفقي. تأكد من ليس لديهم أي فقاعة الهواء في النظام ، والتي من شأنها أن بطء زمن الاستجابة وانخفاض دقة MMP.
• تغيير إلى أعلى التكبير على المجهر واستخدام رمش رقيق التعامل مع (تيد بيلا 113) لوضع اليرقات السمكية الظهرية الجانب السلبي مع صفار قريبة جدا من عقد ماصة. عقد السمك اليرقات التي تمتص صفار في ماصة عقد من خلال تحويل عقارب محرك ميكرومتر السيطرة على ضخ microsyringe اليدوي. الحرص على عدم تحويل ميكرومتر بعيدة جدا ، كما يمكن أن تنفجر إذا صفار سحبت عميقة جدا في عقد ماصة. التركيز على تشكيل الوريد الكاردينال المشتركة ، والتي تقع على صفار ، تماما تحت ومحيط بالأدمة هو موقع تدفق الدم عالية جدا. مع micromanipulator جهاز الحقن ، دليل الإبرة في الوريد النامية الكاردينال المشتركة. فمن عادة اللازمة لسحب إبرة الظهر قليلا بعد الإدراج ، كما الوريد المشترك الكاردينال سطحي جدا. حقن 1nl حل عن طريق الضغط على دواسة القدم ، ثم حرر اليرقات من ماصة القابضة وإعادتها إلى المياه الجنين. هذا هو خطوة حاسمة ، وخصوصا في المرة الأولى ، لأنه يتطلب كمية معينة من الممارسة في وضع الأسماك والسيطرة على الضغط والشفط للتلاعب. إذا عقد صحيح صفار الجنين مع ماصة عقد ، فإنه لن لفة كما يدخل إبرة.
• للتحقق من نجاح microinjection ، ورصد وجود ديكستران الصفراء إبليس في قلب من الزرد تحت المجهر الفلورسنت. الأصفر وسيفر ظاهرا في قلب لحوالي 20 دقيقة قبل ان يشتت في نظام الدورة الدموية إذا تم حقن محلول كلى بشكل صحيح ، في حدود 2 ساعة من الحقن سترى القليل جدا لوسيفر الصفراء ديكستران المتبقية في موقع الحقن. وإذا تم حقن المحلول في كيس المح ، بقعة صفراء وسيفر ديكستران تبقى في موقع الحقن. (الشكل 1). عودة إلى متوسطة السمك E3.
• بعد يومين من الحقن ، واليرقات تطوير ذمة تأموري نتيجة لانخفاض وظائف الكلى (الشكل 2).

الجزء 2 : التثبيت والمناعي مع نا ⁺ / K الضد أتباز ⁺ (α - 6F)

• عند 4 DPF ، وطرح ما بين 10 و 15 الزرد اليرقات في قوارير الزجاج 4ml (Weathon ، 225012) ، ولهم في الإصلاح ودنت 1ml (80 ٪ MeOH DMSO 20 ٪) لمدة 4 ساعات في RT.
• ترطيب الأجنة في MeOH متدرج / PBT (PBS مع 0.5 ٪ Tween20) السلسلة ، 75:25 50:50 ، 25:75 ، PBT 100 ٪ ، pipetting حل خارج الحل وإضافة جديدة إلى نفس القنينة (1ml من الحل في فيال) ، و 20 دقيقة في كل حل. لا ينبغي أبدا أن تكون يرقات تعرضه للهواء ، وترك حل القليل الذي يغطي اليرقات عند تغيير الحلول.
• إزالة واستبدال PBT 1ml مع حل حجب (PBS مع DMSO 1 ٪ ، 0.5 ٪ Tween20 ، و 10 ٪ مصل الماعز العادي) لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية على nutator.
• نقل اليرقات في microfuge 2ml. إزالة الحجب المصل واستبدالها مع الأجسام المضادة الأولية 300μl في محلول الحضانة (PBS مع DMSO 1 ٪ ، 0.5 ٪ Tween20 ، الماعز العادي المصل 2 ٪) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على nutator. نستخدم حيدة النسيلة نا ⁺ / K الضد أتباز ⁺ (α - 6F ، طاف ، والدراسات التنموية ورم هجين البنك ، آيوا) في التخفيف 01:25
• إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل 3 × 30 دقيقة مع الحل في حضانة RT.
• المخفف مع احتضان الضد الثانوية (الماعز المضادة للماوس cy3 ، جاكسون Immunoresearch المختبرات ، وشركة 155-165-003) 1:500 الحل في الحضانة لمدة 2 ساعة فيRT.
• تغسل 3 × 30 دقيقة مع PBT.

الجزء 3 : تضمين بلاستيك مع JB - 4

• يذوى الأنسجة من خلال سلسلة متدرجة الإيثانول (50 ٪ و 75 ٪ ، 95 ٪ و 100 ٪ × 2) ، 10 دقيقة لكل خطوة.
• إعداد الحل تسلل : 25 مل من محلول JB - 4 تضمينها A (Polysciences 0226A) و0.24g من الحفاز (Polysciences 02618). يستغرق بعض الوقت للحافزا على حل ، على بعد حوالى 20-30 دقيقة. ويمكن تخزين الحل في 4 درجات مئوية تصل إلى 1 في الشهر.
• صب قبالة الإيثانول بنسبة 100 ٪ واستبدال الحل تسلل من البلاستيك. ضع قارورة على 4 درجات مئوية على محور دوار ، والسماح للشروع تسلل حتى تغرق اليرقات في الجزء السفلي من القارورة الزجاجية. هذه العملية تستغرق عادة حوالي 30 دقيقة.
• تضمين البروتوكول : ضع الكأس صب علبة من البلاستيك (Polysciences ، وشركة 16643A) تحت مجهر تشريح. نقل اليرقات ، جنبا إلى جنب مع الحل لتغطية تسلل ، في الكؤوس. وسائل الإعلام مستعدة تضمين البلاستيك في أنبوب صغير من البلاستيك. نحن عادة تضمين 4-5 السمك في وقت واحد عن كل الأسماك الكأس. إعداد 5-6 مل من البلاستيك التضمين (1.2 مل من حل لتضمين كل كوب) إضافة 35 ميكرولتر من JB - 4 "ب" التضمين محلول (شركة Polysciences 0226B) لكل مل من حل التسلل. إضافة 35 ميكروليتر من "باء" JB - 4 الحل تضمينها (Polysciences شركة 0226B) لكل مل من حل التسلل. المزيج جيدا ، pipetting صعودا وهبوطا مع البلاستيك مرات عدة ماصة باستور. هذا مهم جدا لأنه إذا لم يكن جيدا مختلطة JB - 4 ولن تتبلمر صحيح. وقد أعد بعد 5ml من البلاستيك التضمين ، وإزالة البلاستيك حول تسلل من العينات مع ماصة باستور. ملء الكأس مع تضمين البلاستيك. يجب أن يكون البلاستيك تنز من الكأس ، لضمان مرفق جيدة لحامل كتلة في العينة. للكشف عن الزرد الأنابيب الكلوية ، المقاطع العرضية هي أفضل. لهذا الغرض ، هي جزء لا يتجزأ من الأسماك عموديا ، الرأس الى أسفل. بمساعدة لها جفن أو ملقط مع مقبض غرامة ، والموقف دوريا الأسماك عموديا ، حتى من البلاستيك الصلب ويكفي أنها لا تتحرك من موقفها. يستغرق حوالي 20-30 دقيقة. ثم ، ضع حامل EBH - 2 بلوك (15899 Polysciences شركة) على كؤوس وترك علبة في 4 درجات مئوية خلال الليل. عندما البلمرة في الكامل ، يمكنك البوب ​​كتل مثل مكعبات الثلج.
• البديل تضمين بروتوكول ليرقات متعددة : املأ قوالب منتصف الطريق مع استكمال JB - 4 والسماح لها تتبلمر. لقوالب 15 مم مربع نستخدم حجم JB - 4 في 700μl لملء القالب في منتصف الطريق. المقبل ، إضافة اليرقات JB - 4 غارقة مع تصليب إلى قوالب نصف مليئة قبل بلمرة. توجيه اليرقات مع رئيس لافتا نحو الجانب البعيد من العفن ومحاذاة اليرقات حتى يصل خط مقل العيون (10 يمكنك وضع الأسماك في قالب واحد في الخط). بعد بلمرة الكتلة يمكنك قص حواف كتلة ، وتحويله بحيث تواجه الجانب السكين وsuperglue فإنه إلى "تشاك" البلاستيكية التي تناسبها في مشراح. مع هذا الأسلوب يمكنك وضع عدد كبير من اليرقات في نفس المبنى ، الذي تركز في البلاستيك ، وعلى استعداد لمقاطع عرضية. الرعاية يجب أن يؤخذ على توجيه كتلة السكين بحيث تتخذ كل المقاطع يعادل السمك في مقطع واحد. ويمكن تحقيق هذا في حين sectioning من خلال عيون : أي توجيه الكتلة بحيث تؤخذ أقسام يعادل العينين لكل السمك. والنتيجة النهائية هي أنه يمكنك تحليل العديد من الأسماك بصورة متزامنة على شريحة المجهر واحد.

الجزء 4 : Sectioning

• مجموعة العينة في حامل تشوك للمشراح (نستخدم الجودة Shandon الحرارية الكهربائية مؤسسة مشراح)
• تعيين الشريحة الأكثر دفئا الى 45 درجة مئوية.
• صب الماء في دي كوب ووضعه على مقربة من مشراح
• قبل sectioning ، تأكد توجه كتلة مثل الحصول على مقاطع عرضية مثالية من الأسماك. يمكن للروافع التكيف التوجه يمكن استدارة الرأس مواتية لموقف رئيس العينة بدقة لالسكين. البدء في قطع سميكة من خلال المقاطع الرأس من الأسماك. بينما sectioning من خلال العينين ، وتوجيه كتلة بحيث تؤخذ أقسام يعادل العينين لكل السمك. عندما تظهر الزعانف الصدرية في الفروع ، وهذا هو عندما نبيبات سليفة البداية. من هذه النقطة ، وقطع حوالي 32 4 أبواب أم من كتلة.
• جمع الأجزاء مع ملقط والسماح لهم تسقط في كوب من الماء ، دون لمس الماء مع ملقط. المقطع ستوسع حالما يضرب سطح الماء ، والآن يمكنك جمع على شريحة. إدراج الشرائح في الماء بزاوية 45 درجة والنهج القسم بمساعدة لها جفن مع مقبض ، ولمس أن حدود هذا الباب.
• احتضان الشرائح على شريحة دفئا حتى تجف تماما.
• أقسام الصور باستخدام المجهر epifluorescent أو مبائر.

الجزء 5 : الممثل بحوثults

عندما يقوم بشكل صحيح ، والأسماك مثل حقن تظهر في الشكل 1 ، مع القليل ديكستران فلوري (في هذه الحالة لوسيفر الاصفر) مرئية في القلب والدورة الدموية في النظام. إذا كان الحقن هو عميق جدا ، يمكن أن ينظر إلى حقن المواد تتركز في الكيس المحي ، أو يمكن أن يسبب ثقب في القلب النزيف. إذا تم عقد ماصة بشكل صحيح ، فإن الأسماك لا لفة أو نقل عند حقنه ، وهذا سوف يسمح لحقن أكثر دقة. أيضا ، من المهم للتأكد من ليس لديهم أي فقاعات هواء في MMP ، والذي سوف يؤدي إلى إبطاء وقت الاستجابة وانخفاض دقة النظام. عموما ، نتيجة للجنتاميسين الكلوي ، و 80 ٪ من الأسماك حقن تطوير ذمة التامور (الشكل 2). نستخدم نظام التصنيف يستند النمط الظاهري ، الذي السمك مع وذمة وذمة معتدل تظهر واضحة ولكن لا تأموري الآخرين ملاحظتها الظواهر ، في حين أن الأسماك تظهر بشدة ذمي ذمة التامور والجذع ، مع انحناء خفيف إلى معتدل المحور. باستخدام الأجسام المضادة ضد نبيب كلوي نا ⁺ / K ⁺ أتباز (α - 6F) يمكننا تصور الأنابيب التالفة في الفروع عرضية ، مع خسارة واضحة للقطبية الخلية وتعطل الأنابيب التالفة في أنبوبي بالمقارنة مع الضوابط (الشكل 3). وينسجم هذا النمط من خلال المقاطع المستعرضة متعددة. من أجل الحصول على مقاطع عرضية مثالية من الأنابيب الكلوية المهم أن موقف السمكة بشكل صحيح خلال التضمين. عند المقارنة بين المقاطع ، وتستخدم الزعانف الصدرية والأنابيب الملتوية القريبة كعلامات التشريحية.

الشكل 1. microinjection Nephrotoxin. (A) حقن الناجح لديكستران 10kDa مترافق لوسيفر الصفراء ، مع التعبير خافت في الوريد الكاردينال المشتركة ، السهم الأبيض. (ب) الحقن غير الصحيحة ، مما أدى إلى إيداع ديكستران 10kDa مترافق لوسيفر الصفراء التي لا تتبدد في نظام الدورة الدموية ، والسهم الأحمر.

الشكل 2. جنتاميسين بوساطة ذمة. (أ) مراقبة حقن الزرد اليرقات. جنتاميسين حقن الزرد مع اليرقات (B) أو معتدلة (C) وذمة شديدة. جميع اليرقات في 4 DPF مع الأمامي إلى اليسار والظهرية متروك. السهام السوداء أشر إلى ذمة تأموري باء وجيم.

الشكل 3. آكي المناعية. α - 6F تلوين الأجسام المضادة ^لل+ / K ⁺ نا أتباز حقن جنتاميسين 48 ساعة آخر (4 اليرقات DPF) في السيطرة (A ، B) ، وجنتاميسين حقن (C ، D) اليرقات. A ، C هي في 20X التكبير وباء ودال وتكبير رقمي 3X من نبيبات الحق في الخسارة ملاحظة ألف وجيم من الاقطاب basolateral والتعطيل أنبوبية ، السهم الأبيض ، في مد مقارنة ب

Discussion

في هذه المقالة الفيديو أثبتنا تقنية microinjection الوريد للنموذج آكي ، من خلال خلق جنتاميسين بوساطة الضرر أنبوبي الداني في يرقات الزرد. نتائج هذا الضرر في تشكيل و / أو وذمة تأموري الإجمالي ، مما يعكس عدم القدرة على تنظيم التوازن المائي. كما وصف لنا تجربة مع الأجسام المضادة المناعية التي نبيبات الكلى علامات متباينة (ماجومدار وآخرون 2000) ، والتي تبين فقدان الخلية القطبية واختلال نبيب الداني في الكلى التالفة. microinjections الوريد تمثل وسيلة فعالة لتقديم مادة قابلة للذوبان في مجرى الدم من اليرقات الزرد. هذا الأسلوب هو أداة ممتازة لإدخال مجموعة متنوعة من المواد وبمساعدة من الحقن علامة موحدة الفلورسنت يمكن أن يتكرر عدة مرات السماح لنتائج متسقة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope