Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Summary

Demostramos un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta basada en la disección de los fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, seguido de la extracción del resto del axón material enriquecido.

Abstract

El aislamiento de citoplasma pura axonal (axoplasma) de los nervios periféricos es crucial para los estudios bioquímicos de muchos procesos biológicos. En este artículo, demostrar y describir un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta sobre la base de los siguientes pasos: (1) la disección de los fascículos nerviosos y la separación del tejido conectivo, (2) la incubación de segmentos cortos de fascículos nerviosos en medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, y (3) la extracción del resto del axón material enriquecido. Caracterización proteómica y bioquímica de esta preparación ha confirmado un alto grado de enriquecimiento para los componentes axonal.

Protocol

Este protocolo permite el aislamiento axoplasma con la minimización de la contaminación de los tejidos gliales y vasculares. El método de producción de aproximadamente 70-100 mg de proteína total por axoplasma un 80-10 semanas de edad, la rata Wistar.

1. Disecar los nervios ciáticos

1. La eutanasia a dos ratas por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical. Confirmar la muerte mediante la palpación de la falta de ritmo cardíaco antes de la disección principio.
2. Limpie el área de disección con etanol al 70%.
3. Cortar la piel, los músculos separar y aislar el nervio ciático con tijeras y pinzas con cuidado, sin dañar los vasos sanguíneos. Diseccionar los nervios ciáticos (alrededor de 1,5 cm cada uno) de cada animal y recoger los cuatro nervios en un eppendorf con 500 l de PBS 0,2 X + inhibidores, se mantuvo en hielo.
4. La transferencia de los segmentos de los nervios a los platos de plástico que contienen al menos 2 ml de PBS 0,2 X + inhibidores de la proteasa.
5. Retire el epineuro de los nervios usando unas pinzas finas en el ámbito binocular. Separar los fascículos con mucho cuidado hasta que se enturbie y comienzan a flotar en la superficie de la solución. Este paso debe ser practicado hasta que pueda llevarse a cabo con rapidez y precisión (no tomar más de 10 minutos por los nervios).

2. Incubación, lavado y elución

1. Transferencia de fascículos separados a un tubo Eppendorf con 500 l de PBS 0,2 X contiene inhibidores de la proteasa para la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente.
2. Lavado por lo menos 3 veces con 1 ml del mismo tampón mediante la transferencia de los fascículos del tubo eppendorf al tubo eppendorf y agitar durante 5 min después de la transferencia.
3. Para eliminar el exceso de fluido que los fascículos en un nuevo tubo eppendorf vacío y luego transferir los fascículos a un nuevo tubo eppendorf con 300 L de PBS 1X que contiene inhibidor de la proteasa para la incubación durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.
4. Centrifugar 10 minutos a 10.000 xga 4 ° C.
5. Tomar el sobrenadante y medir la concentración de proteínas. Esta es su preparación axoplasma.

3. Resultados representante

Figura 1. Axoplasma Western blot comparar aislados por el método de apriete manual con las muestras de axoplasma aislado como se muestra en este protocolo. Tenga en cuenta la reducción de los niveles de albúmina y GFAP, en representación de proteína de la sangre y la contaminación de células gliales, respectivamente. Por el contrario, axonal tubulina b3 se enriquece en esta preparación, lo que indica un alto nivel de proteínas axonal.

Discussion

Los análisis bioquímicos y proteómica han confirmado que este procedimiento reduce la contaminación de células gliales en suero y ³ en comparación con los métodos descritos anteriormente para el aislamiento de axoplasma por presión mecánica ^1. Hemos utilizado este protocolo de aislamiento para explorar axoplasma dineína basado en la señalización retrógrada después de la lesión del nervio ciático ^2, y esperamos que tenga utilidad en la exploración de muchos otros procesos en los nervios periféricos para adultos, incluyendo las interacciones de las células de ^axón-4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).