Detecção de Atividade Neu1 sialidase em Regulação Toll-like receptor de ativação

Summary

O ensaio sialidase é uma abordagem simples técnica que irá elucidar mecanismo molecular romance (s) de sensores de TLR de infecções microbianas e envolvimento em doenças inflamatórias ao nível do receptor na superfície celular de macrófagos ao vivo.

Abstract

Mamíferos Toll-like receptors (TLRs) são uma família de receptores que reconhecem patógenos padrões moleculares associados. Não são apenas os TLRs sensores crucial da microbiana (por exemplo, vírus, bactérias e parasitas) infecções, eles também desempenham um papel importante na fisiopatologia de doenças infecciosas, doenças inflamatórias e, possivelmente, em doenças auto-imunes. Assim, a intensidade ea duração das respostas TLR contra as doenças infecciosas devem ser rigorosamente controladas. Segue-se que o entendimento a integridade estrutural dos receptores de sensor, suas interações ligante e componentes de sinalização é essencial para a proteção imunológica subseqüentes. Seria também oferecem oportunidades importantes para a modificação de doenças através da manipulação sensor. Embora as vias de sinalização de sensores de TLR estão bem caracterizadas, os parâmetros de controle de interações entre os sensores e seus ligantes ainda permanecem mal definidos. Recentemente, identificou um novo mecanismo de ativação do TLR por seu ligante natural, que não foi observado anteriormente ^1,2. Ele sugere que a ativação induzida por ligante TLR é rigidamente controlado por Neu1 ativação sialidase. Temos também informou que Neu1 regule receptores neurotrofina como TRKA TrkB e ^3, que envolvem Neu1 e matriz metaloproteinase-9 (MMP-9) cruzada no complexo com os receptores ^4. O ensaio sialidase foi inicialmente usado para encontrar um romance ligante thymoquinone, na ativação de Neu4 sialidase na superfície celular de macrófagos, células dendríticas e células fibroblasto via GPCR Gαi proteínas e MMP-9 ^5. Para os receptores TLR, nossos dados indicam que Neu1 sialidase já está em complexos com receptores TLR-2, -3 e -4, e é induzida mediante ligação do ligando a qualquer receptor. Ativado Neu1 hidrolisa sialidase sialil α-2 ,3-β-ligados galactosyl resíduos distante ligação do ligando para remover impedimento estérico a TLR-4 dimerização, MyD88/TLR4 recrutamento complexo, NFkB ativação e respostas pró-inflamatórias da célula. Em um relatório de colaboração, sialidase Neu1 foi mostrado para regular a fagocitose em macrófagos ^6. Tomados em conjunto, o ensaio sialidase nos forneceu insights poderosos para os mecanismos moleculares do ligante induzida por ativação do receptor. Embora a relação exata entre Neu1 sialidase e ativação de TLR, receptores Trk ainda não foi completamente elucidado, isso representaria uma nova abordagem ou pioneira de vias de regulação celular.

Protocol

1. Ressuscitando macrófagos Congelados

1. Antes de ressuscitar células congeladas do freezer -80 ° C, é preciso preparar meio de cultura usando estéril filtrado Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) e 5 mg / mL de plasmocin. Plasmocin é uma solução de antibiótico utilizado em nossa pesquisa para eliminar e evitar a contaminação por micoplasma em culturas de células.
2. Para um frasco de células congeladas, acrescenta um 4 mL, 1 mL do meio de cultura para um frasco de 25 centímetros cultura ² células em uma capa de contenção de risco biológico estéril.
3. Quando o frasco de células congeladas são retiradas do freezer -80 ° C, eles são rapidamente descongeladas pelo aquecimento mão no capô estéril, que leva cerca de 2-3 min.
4. Assim que as células são descongeladas, eles são rapidamente transferidos para o balão contendo o meio condicionado utilizando uma pipeta de 1 mL estéril.
5. O frasco contendo as células são colocadas em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C e 5% CO _2.
6. As células marcada para o crescimento e adesão em uma base diária até que se tornem 75% a 90% confluentes usando um microscópio invertido.
7. Durante a incubação de cultura de células, 12 mm lâminas de vidro circular são esterilizados, cobrindo-os em etanol 70% em um grande prato de vidro petri por 1 hr no gabinete de contenção de risco biológico, o álcool é posteriormente removido e armazenado para reusage, e as laterais de vidro molhado são deixados expostos ao fluxo de ar filtrado estéril no gabinete sob um UV por 24 horas ou até que estejam secos.

2. Células chapeamento para o ensaio sialidase

1. Antes do plaqueamento das células, uma única lâmina de vidro estéril circular é cuidadosamente colocado em um poço de uma BD Falcon 24 poços de fundo plano com tampa da cultura de tecidos placa de poliestireno tratada usando uma curva completa sterilized flamejante, 4 ", serrilhada, de aço inoxidável fórceps . Para um frasco de células em confluência de 75%, normalmente os usamos 12 poços da placa de cultura.
2. Para as células de macrófagos aderentes, o meio DMEM condicionado é removido do frasco utilizando uma pipeta de 5 mL estéreis no gabinete de contenção estéril. Lave as células aderentes uma vez com Tris buffered 1x estéril salina pH 7,4 para remover qualquer meio de soro contendo, e adicionar 1 mL de cálcio médio livre de fosfato (CMF) solução salina tamponada, pH 7,4, o suficiente para cobrir as células. As células são colocadas na incubadora a 37 ° C por aproximadamente 10 min ou até que as células começam a decolar no frasco. O frasco pode ser balançado suavemente ou agitado para soltar qualquer resquício de células aderentes.
3. Para a 1 mL de células em suspensão no frasco, adicionar 3 mL de DMEM meio condicionado. Tomar 0,5 ml de células em suspensão e esterilizados transferiu-os para a placa de tecido cultivado contendo os 12 milímetros lâminas de vidro circular. Aproximadamente, 0,5 x 10 ⁶ células são transferidas para a lâminas de vidro circular.
4. O tecido células de cultura contendo placa são incubados a 37 ° C em 5% CO ₂ por 24 horas, a fim de permitir que as células aderem à lâminas de vidro circular.

3. Ensaio sialidase

1. Tornando o controle

1. Coloque uma lâmina de microscópio (fosco: uma final, 1slide, 25 x 75 x 1 mm) no gabinete de contenção ou de bancada de laboratório e adicione, misturando em ordem seqüencial os seguintes compostos: 1 mL DAKO + 1 mL de 4-Muñana e por último + 3 mL de Tris buffered saline pH 7,4 (TBS).
2. Depois de remover a mídia de um poço que contém as células, levante cuidadosamente a lâmina de vidro circular com os 4 fórceps "para o canto do bem. Retire cuidadosamente a lâmina de vidro com a pinça e coloque o slide com as células virada para a solução de mistura em a lâmina de microscópio.
3. Imediatamente, tomar o slide microcope a um microscópio epi-fluorescente que foi definida para o filtro UV e tem uma câmera digital para capturar as imagens fluorescentes.
4. O foco do microscópio em contraste de fase até que você possa ver as células e então mudar para o modo fluorescente. Tirar fotos das células sob luz fluorescente de 1 min, 2 min e 3 min. Tire uma foto única das células sob contraste de fase.

2. Fazendo o teste positivo

1. Identificar os compostos a seguir na ordem seqüencial em outra lâmina de microscópio: 1 mL DAKO + 1 mL de 4-Muñana mL + 2 de LPS + 1 mL de TBS.
2. Repita os passos 3.1.2 a 3.1.4 acima.

3. Fazendo o teste positivo juntamente com inibidor da neuraminidase Tamiflu

1. Identificar os seguintes compostos na seguinte ordem seqüencial em outra lâmina de microscópio: 1μL DAKO + 1μL de 4-Muñana + 2 mL de LPS + 1 mL de Tamiflu.
2. Concentrações Tamiflu são pré-preparados em 1x Tris buffered saline pH 7,4; a concentração final dos compostos em contato com as células vivas na lâmina de vidro circular terá um fator de diluição de 5.
3. Repita os passos 3.1.2 a 3.1.4 acima.

4. Determinação da Concentração de Inibidores necessárias para inibir 50% da Atividade sialidase (IC ₅₀₎

1. Para quantificar o fluorescente em torno das células, as imagens são analisadas utilizando ImageJ 1.38x com o plugin para medir analisar RBG. Ter 50 leituras aleatórias da fluorescência em torno das células e calcular a média da fluorescência total.
2. O IC ₅₀ é gerada a partir de um gráfico da concentração de inibidor convertidos em unidades de log (por exemplo, log ng / mL) no eixo x, contra a fluorescência média no eixo y por meio de regressão não-linear.

5. Segredos para o Sucesso

1. Certifique-se que as células em cultura são a contaminação livre de micoplasma. Nós usam rotineiramente Plasmocin em meio de cultura para controlar isso.
2. O substrato artificial neuraminidase, 4-Muñana, devem ser utilizados preparados na hora. O substrato preparado pode ser usado dentro de uma semana para o ensaio sialidase.
3. Se a linha de célula tem um expressão de receptores de baixo na superfície da célula, pode-se usar uma dose mais elevada do ligante para a estimulação.
4. Temos também que as células experientes várias passagens por mais de 6 vezes pode perder seu fenótipo do receptor. Recentemente, as células ressuscitado deve ser cultivado.

6. Resultados representante

Ver protocolo de animação do ensaio sialidase com resultados representante no anexo arquivo Powerpoint .

Discussion

Utilizando o teste recentemente desenvolvido para detectar atividade de sialidase em células macrófago vivo ^2, usamos essa tecnologia para detectar atividade de sialidase em ligante induzida por atividade sialidase em viver BMC-2 macrófagos de uma forma dependente da dose, bem como em viver DC-2.4 células dendríticas , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 nas células mamárias adenocarcinoma, WT humanos e 1140F01 e WG0544 tipo I fibroblastos sialidose. Inibidores da neuraminidase, como o Tamiflu (fosfato de oseltamivir) inibiu thymoquinone induzida por atividade sialidase em viver BMC-2 células com ₅₀ mM de 0,0194 IC em comparação com um IC ₅₀ de 19,17 M para neuraminidase inibidor DANA (2-desoxi-2 ,3-dehidro- DN-acetilneuramínico ácido) ^5. Temos também informou que outras aplicações tais como anticorpos específicos anti-Neu1, -2 e 3 não têm nenhuma inibição da atividade induzida TQ-sialidase em viver BMC-2 e humanos THP-1 macrófagos, mas os anticorpos anti-Neu4 bloquear completamente esta atividade. Há uma aplicação da atividade sialidase para detectar uma atividade vigorosa sialidase associados TQ tratados de medula óssea ao vivo primária (BM) macrófagos derivados de catepsina WT e hypomorphic Um ratos com uma deficiência Neu1 secundário (NeuI KD), mas não Neu4 knockout ( Neu4 KO) ratos ^1,2,5. Além disso, a toxina pertussis (PTX), um inibidor específico das proteínas Gαi da proteína G do receptor acoplado (GPCR) e os inibidores da ampla gama de matriz metaloproteinases (MMP) galardin e piperazina aplicada a viver BMC-2, THP-1 e primário macrófagos BM bloquear completamente a atividade induzida TQ-sialidase ^5. Estes mesmos efeitos inibitórios não são observadas com o gangliosídeo GM1 específicas toxina da cólera subunidade B (CTXB), bem como com CTX, inibidor da tirosina quinase K252a, ea ampla gama inibidor GPCR suramin. O inibidor específico da MMP-9, anti-MMP-9 e anticorpos anti-Neu4 de anticorpos, mas não o inibidor específico da MMP-3 completamente atividade sialidase bloco TQ-induzida em viver THP-1 células que expressam Neu4 e MMP-9 na superfície celular ^5.

Tomados em conjunto, o ensaio sialidase pode ser usado para fornecer insights poderosos para os mecanismos moleculares do ligante induzida por ativação de receptores envolvendo sialidases como Neu1 ou Neu4 dependendo da natureza do ligante. A rapidez da atividade sialidase ligante induzida mediada pelo receptor-ligante ligado sugere que os receptores glicosilada como NGF TRKA, TrkB BDNF e receptores toll-like forma um paradigma de sinalização na membrana de superfície celular que envolve uma plataforma organizacional molecular do ligante-receptor ligado , Gαi proteínas, MMP-9 e Neu1 ou Neu4 sialidase. Ligação do ligando respectivos receptores induz a atividade sialidase GPCR através de sinalização através da membrana Gαi proteínas e ativação de MMP-9. Neu1 ou Neu4 e MMP-9 cross-talk no complexo com o receptor na superfície da célula permite uma rápida ativação da sialidase impedimento para remover o ácido siálico estérico-receptor para a associação na geração de um receptor funcional.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG