Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von primären Zellen losgelöst von<em> Drosophil</em> A Embryonen. Die Fähigkeit zur Durchführung der effektive RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen und bildgebenden Verfahren Zelle ermöglicht eine Vielzahl von Fragen, die in adressiert werden<em> Drosophila</em> Primärzellen.
Abstract
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung und Kultivierung primärer Zellen losgelöst von Drosophila Gastrula Embryonen. In kurzen, inszeniert eine große Menge von Embryonen von jungen und gesunden Fliegen gesammelt, sterilisiert und dann physisch trennen in einer einzigen Zellsuspension mit einem Glas-Homogenisator. Nachdem er auf Kulturplatten oder Kammer-Objektträgern in angemessener Dichte an Kultur-Medium, können diese Zellen weiter in mehrere morphologisch-verschiedene Zelltypen, die durch ihre spezifischen Zell-Marker identifiziert werden können differenzieren. Darüber hinaus präsentieren wir die Bedingungen für die Behandlung dieser Zellen mit doppelsträngiger (ds) RNA Gen-Knockdown zu entlocken. Effiziente RNAi in Drosophila primären Zellen erfolgt durch einfaches Baden die Zellen in dsRNA-haltigen Kulturmedium erreicht. Die Fähigkeit zur Durchführung von effektiven RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen, Cell Imaging-Analysen erlauben eine Vielzahl von Fragen, die in Drosophila primären Zellen, insbesondere in Bezug auf differenzierte Muskel-und Nervenzellen beantwortet werden.
Protocol
1. Vorbereitung fliegen Käfige Wachsen Drosophila (Wildtyp-Stämme wie Oregon-R oder Genotyp) in bequemen Behälter, wie 32-oz Insekten Tassen. Transfer neu eclosed fliegt zu großen Embryo-Sammlung Käfigen oder fliegen Bevölkerung Käfigen. Bewegen Sie den Käfigen in einen Raum mit einer Temperatur von ~ 25 ° C und Luftfeuchtigkeit bis 65% in einer leichten 12-h und einem dunklen 12-h-Zyklus, um die Sammlung von Synchron-Embryonen zu erleichtern. Pflegen Sie die Fl…
Discussion
Die Entwicklungsmuster der primären Kulturen von Drosophila-Zellen können sehr unterschiedlich sein, was möglicherweise auf die verschiedenen Variablen während der primären Zelle Herstellungsverfahren. Zunächst fliegt zur Eiablage verwendet werden soll jungen (innerhalb einer Woche alt) und gesund (frei von viralen oder bakteriellen Infektion). Unbefruchtete oder infizierten Embryonen müssen vermieden werden, da sie nutzlos und werden die Zellen aus den Embryonen nicht unterscheiden kann und wird nur fü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB wurde von der Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716 bis 1702 unterstützt. JZ wurde durch die NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02 unterstützt. NP ist ein Ermittler des Howard Hughes Medical Institute.