Summary
I många biologiska och kliniska situationer är det fördelaktigt att studera cellulära processer som de utvecklas i sitt hemland mikromiljö. Här beskriver vi montering och användning av en låg kostnad fiberoptiska mikroskop som kan ge realtid bildbehandling i cellkultur, djurstudier och kliniska studier patient.
Abstract
Många biologiska och kliniska studier kräver longitudinell studie och analys av morfologi och funktion med cellnivå upplösning. Traditionellt finns flera experiment parallellt med individuella prover bort från studien vid sekventiell tidpunkter för utvärdering av ljusmikroskop. Flera intravital har utvecklats, med konfokal, multiphoton, och andra övertonen mikroskopi alla visar sin förmåga att kunna användas för avbildning på plats 1. Med dessa system är dock nödvändig infrastruktur komplexa och dyra, med scanning och komplexa ljuskällor. Här presenterar vi ett protokoll för konstruktion och montering av en högupplöst microendoscope som kan byggas på en dag med off-the-shelf komponenter för under US $ 5000. Plattformen erbjuder flexibilitet när det gäller bildupplösning, fält-of-view, och drift våglängd, och vi beskriva hur dessa parametrar kan enkelt ändras för att möta de särskilda behoven hos slutanvändaren.
Vi och andra har undersökt användningen av högupplösta microendoscope (HRME) i cellodling in vitro 2-5, i censurerade 6 och levande vävnader djur 2,5, och i mänskliga vävnader in vivo 2,7. Användare har rapporterat att använda flera olika fluorescerande kontrastmedel, inklusive proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivat monoacid ring A (BPD-MA) 5, och fluoroscein 6,7, som alla har fått full eller prövningsläkemedel godkännande från FDA för användning på människor. Högupplöst microendoscopy, i den form som beskrivs här, kan överklaga till ett brett spektrum av forskare som arbetar i de grundläggande och kliniska vetenskaper. Tekniken erbjuder en effektiv och ekonomisk metod som kompletterar traditionell bänk mikroskopi, genom att ge användaren att utföra högupplösta, längsgående avbildning på plats.
Protocol
1. Microendoscope Assembly
Den högupplösta microendoscope beskrivs här (Figur 1a) bör betraktas som en grundkonfiguration med flera variationer möjligt i montering och tillämpning. Vi beskriver i detalj här ett förkroppsligande av den plattform som är utformad för att användas med proflavine som fluorescerande kontrastmedel. Proflavine är ett ljust kärnvapen fläcken med maximal absorption och våglängder utsläpp av 445 nm och 515 nm respektive. Användning av andra kontrastmedel kommer att kräva att användaren kan välja excitation, utsläpp och dikroiskt filter lämpligt sätt. Flera delar av högupplösta microendoscope är generiska och kan erhållas från flera leverantörer. Till exempel optomechanical positionering komponenter är tillgängliga från Thorlabs, Newport, Linos bland annat. Kompakt CCD-kameror är tillgängliga från företag inklusive Point Grey Research, Prosilica och Retiga, ljuskänslighet bör väljas med hänsyn till ljusstyrka fluoroforen som ska användas, liksom den önskade bildfrekvensen. Hög effekt lysdioder (LED) kan erhållas från Luxeon, Cree och Nichia bland annat. Fiberoptiska buntar finns från Sumitomo, Fujikura, och Schott. I valet av komponenter för ett visst program bör användaren överväga att den inneboende relationer inblandade i fluorescensmikroskopi mellan fluoroforen koncentration, fotoblekning, belysning intensitet, ljuskänslighet, förstärkning, och exponeringstid.
- Anslut 6 "bur stavar till 1,5" bur stavar, för att bilda ett par 7,5 "långa stavar. Skruva dessa spön till ett ansikte gånger spegeln enheten. Skruva 0,5" spön i motsatsen ansiktet. Skjut buren kuben på buren stavar, via de två nedre genomgående hål. Skruva fast 2 "spön i sidan ansiktet av buren kuben (figur 1b).
- Anslut kameran till en bur tallrik med hjälp av en C-fäste till SM1-adapter. Fäst buren plattan på 0,5 "bur stavar, skölj med tanke på de gånger spegeln enheten.
- Sätt i "tuben" objektiv till ett 3 "långt linsens röret och säkra objektivet med en låsring. Brännvidden på objektivet bör väljas så att kärnor av fiberoptiska bunt samplas av minst två pixlar när projiceras på kameran. Drop utsläpp filtret i röret på toppen av den första låsring, och lägga till ytterligare en ring för att säkra filtret på plats. Observera att filtret orientering konventionen anges av filtret tillverkaren. Skruva objektivet röret i sidan av bur kub närmast CCD-kameran. Observera att i figur 1c, är det här objektivet och filtret visas utan 3 "lins slang för tydlighetens skull.
- Anslut kameran till en dator och visa bilden på skärmen. Direkt buren monteringen på ett föremål och skjut buren kuben längs rälsen tills en bild visas i fokus. Låsa buren kuben på denna plats. (Detta är en enkel metod för att säkerställa att röret objektivet kommer att bilda en fokuserad bild när de kombineras med oändligheten korrigerade-objektiv).
- Sätt dikroiskt spegeln i hållaren och placera i 45 ° i buren kuben.
- Skruva fast objektiv, via en RMS till SM1 gängadapter och en justerbar lins rör, i ansiktet av buren kuben motsatta röret objektivet hållaren. En Z-översättare kan användas i stället för justerbar lins röret för enklare fokusering. Skruva en SMA-kontakt i en bur tallrik och montera detta på stavar, ungefär på arbetsplatsen avstånd objektiv.
- Montera en lysdiod på en bur och skjut på slutet av 2 "stavar. Lägg en lins till en 0,5" lins röret så att när detta rör skruvas fast i sidan av buren kuben, bildar en bild av LED som fyller den bakre öppning objektiv. Denna (Kohler belysning) konfiguration kommer att säkerställa att den proximala sidan av fiberoptiska bunt enhetligt lyser. Lägg till excitation filter till 0,5 "objektiv röret och säkra på plats med en låsring (figur 1c).
- Bifoga en SMA-kontakt till en fiberoptisk bunt. Skruva SMA connectorized bunt till SMA-hona monterad på buren stavar. Direkt den distala änden av bunten mot ett bredband ljuskälla (lysrör räcker) och observera bilden av bunten proximala ansikte på CCD-kameran. Justera positionen av objektiv genom att skruva in eller ut ur buren kuben tills fibern bunt bilden visas i fokus. Den individuella kärnor ska vara väl synlig (Figur 2).
2. GRIN Lens Assembly
Den rumsliga upplösningen av microendoscope kan ökas genom att fästa en mikro-linsen, montering till den distala toppen av fiber bunten. Dessa optik är konfigurerade så att istället för att placera bunten spets direkt på vävnaden, är toppen avbildas på vävnaden ytan med demagnification, vilket ökar den rumsliga samplingsfrekvensen ålagts av ljus-GUIDning kärnor av fibern bunten. Graden av demagnification motsvarar ökningen i rumslig upplösning, och på samma gång, en proportionerlig minskning av fält-of-view. Gradient index (GRIN) lins komponenter är kompatibla med fiberoptik och är tillgängliga från GrinTech, NSG, Schott, bland andra, och kan vara direkt bundna till den distala toppen av en fiber bunt.
- Välj ett flin objektiv med önskad förstoring och arbetsavstånd för din ansökan. Se till att diametern på objektivet överstiger fibern paket du planerar att arbeta med. Vi rekommenderar att fibern paket och GRIN objektiv monteras på separata 3-axlig steg manuell positionering i en låg effekt mikroskop eller stereoskopet för noggrann uppriktning före fastsättning.
- Placera en droppe av optiska lim (t.ex. Norland UV-härdande lim) på antingen linsen eller bunt ansikte. Ta de två komponenterna i kontakt med hjälp av manuella lägesställare. Exponera gränssnittet för UV-ljus för den dos som rekommenderas av tillverkaren.
- För att skydda GRIN objektivet och bundna gränssnitt, en kort längd av aluminium kapillär slang (Small Parts Inc.) kan användas för att innesluta det gemensamma. Skjut slangen över den gemensamma och säkra på plats med epoxi. Krympslang kan användas för att avsluta monteringen.
3. Microendoscope Imaging
- Applicera kontrastmedel till celler eller vävnader som ska avbildas. Med proflavine (0,01% w / v i PBS) kan in vitro-avbildning av celler i kultur utförs av kort inkubationstid (<1 minut) och grundlig sköljning. Avbildning av ex vivo vävnadsprover eller in vivo vävnader är möjligt efter lokal applicering av färgen. Upptag av proflavine under dessa förhållanden har visat sig vara nästan momentant, med bildbehandling möjligt inom ett par sekunder och varar i flera minuter.
- Placera fiberoptiska bunt i lätt kontakt med prov som ska avbildas. Vid avbildning celler i kultur eller ex vivo-prov vävnad, rekommenderar vi att montera den distala änden av fibern paket på ett säkert fixtur med manuell positionering steg på XYZ axlarna för stabilitet under avbildning.
4. Representativa resultat:
När den monteras på rätt sätt, kommer microendoscope fungera som ett epi-fluorescensmikroskop, förmedlas genom en konsekvent fiberoptisk bunt. För optimal avbildning resultat bör hänsyn tas till att tre villkor är uppfyllda:
- Den proximala sidan av fiber bunt bör avbildas på CCD-kameran utan minskad fokus, i syfte att uppnå full upplösning av systemet. Figur 2a, b, c visar en del av en fiber bunt avbildade med dålig fokus, lätt minskad fokus och bra fokus, respektive. Det optimala fokus hittas genom att justera axiella position objektiv i förhållande till bunten ansiktet.
- Den proximala sidan av fiber bunt ska vara jämnt belyst under hela sin diameter (field-of-view). Som beskrivs i protokollet Text (1,7) uppnås detta genom att konfigurera belysning optik för Kohler belysning. Figur 2d visar en bild förvärvas när en enhetlig fluorescerande prov är upplyst i detta föredrog konfiguration med figur 2e visar motsvarande resultat i kritisk belysning. I det senare fallet, är strukturen på LED avbildas på fiber bunt ansiktet, vilket resulterade i uppkomsten av denna oönskade mönster överlagrade på den verkliga provet struktur.
- Både den proximala och distala ytor av fiber bunt ska vara ren och fri från repor och chips. Figur 2f visar förekomsten av skräp bifogas bunt ansiktet, med skador i form av ett litet chip vid 5-tiden på fibern omkrets. Skräp kan avlägsnas från bunten ansikten genom att rengöra på samma sätt som konventionella fiberoptiska kontaktdon, med objektiv papper och isopropanol, eller standard fiberoptiska verktyg rengöring. Om endera änden av fibern bunt är repad eller kluvet, eller om bunten bryter längs dess längd, kan ansiktet poleras platt med vanlig manuell eller mekanisk tekniker polering. Vi rekommenderar 12-15 ìm läppning papper för en första grov polska, med en sista touchen på 0,5-1,0 ìm papper.
Figur 3a visar avbildning av 1483 celler in vitro, efter märkning med proflavine och ljus placering av nakna fibern bylte på provet. Figur 3b visar en förbättring av rumsliga upplösningen och minska i fält-of-view som en 2.5x GRIN lins bundna till bunten spetsen. Film 1 visar in vivo avbildning av juverfett pad i en musmodell. Här var en fiber bunt med 0,5 mm ytterdiameter (330 ìm field-of-view) passerade en 21-gauge nål och avancerade i vävnaden. Fettceller syns tydligt, med rörelse på grund av hjärt-cykel tydligt i detta förvärv på 15bildrutor per sekund. Bild 3c visar avbildning i munslemhinnan hos en frisk människa volontär, denna gång med en större fiber bunt med 1,5 mm ytterdiameter (1,4 mm field-of-view). I alla exemplen var proflavine användes som en nukleär märkning fluorescerande kontrastmedel.
Figur 1. Montera högupplösta microendoscope (HRME). (A) Schematisk beskrivning av HRME systemet. (B) Montering av de viktigaste optomechanical stödstruktur. (C) Tillägg av optiska element, LED-belysning, och CCD-kamera. (D) Ett fotografi av den HRME systemet, förpackad i en 10 "x 8" x 2,5 "kapsling.
Figur 2. Ställa in HRME. Exempel på avbildning med fiberoptiska paket i (a) dålig fokus, (b) nära bra fokus, (c) perfekt fokus. I (d), är en enhetlig fluorescerande målet i bunten är distala spets avbildas i Kohler (jämn) belysning. (E) En enhetlig fluorescerande mål avbildas i kritisk belysning, med källan struktur uppenbara på objektet. (F) Lösa vävnader och celler kan hålla sig till fiber bunt ansiktet, som också är utsatt för mindre skador på dess periferi.
Figur 3. Imaging med HRME. (En) 1483 celler in vitro, avbildade med en naken fiber bunt (IGN-08/30) efter märkning med proflavine 0,01% (w / v). (B) Samma 1483 cellodling som visas i (a), avbildade med en fiber bunt med 2.5x GRIN objektiv bifogas. (C) Bild av normala mänskliga munslemhinnan in vivo, efter lokal applicering av proflavine 0,01% (w / v).
Film 1. Imaging juverfett pad av en mus genom införandet av en 450 ìm ytterdiameter fiber bunt i lumen en 21-gauge nål gick i vävnaden. Proflavine 0,01% (w / v) levererades till avbildning plats genom samma kanyl före införandet av avbildning fibern. Klicka här för att se på video
Discussion
Den högupplösta microendoscopy teknik som beskrivs här ger forskare inom den grundläggande biomedicinska och kliniska forskningsområden med en flexibel, robust och kostnadseffektiv metod för att visualisera cellulära detaljer på plats. Vi har beskrivit ett protokoll för montering av bildsystem och visat sin användning i cellodling in vitro, och i djur, och mänskliga vävnader in vivo. Medan avbildning resultat som presenteras här används proflavine som fluorescerande kontrastmedel har andra grupper visat versioner av systemet med LED-belysning våglängder och filter valt att matcha excitation / emission spektra av andra färgämnen 5-7.
Upplösning och field-of-view initialt bestäms av core-to-core avstånd och bildbehandling diameter fiberoptiska paket. Vi har använt buntar med ca 4 ìm core-kärna avstånd och diametrar avbildning av 330 ìm (film 1), 720 ìm (figur 2, figur 3a, b) och 1400 ìm (figur 3c). De mindre buntar som kan skickas genom smalare spårvidd nålar och är betydligt mer flexibel än de större fibrer. Vi och andra 8 har i vissa fall observerat uppkomsten av autofluorescens utsläpp från fibern bunt själv. När du försöker väcka fluoroforer på UV-våglängder, eller samla utsläpp i den röda spektralområdet bör uppmärksamhet fästas vid nivån av fiber bunt autofluorescens bidrar till den totala uppmätta signalen.
Medan de flesta av de högupplösta microendoscopy arbete rapporterats hittills har använt en bar fiber bunt, kan ytterligare förstoring ges med hjälp av GRIN linser bundna till den distala spetsen. GRIN linser erbjuder ett enkelt och ekonomiskt sätt att öka rumslig upplösning, fastän deras känslighet för optiska avvikelser och begränsad NA är väl erkänt. Om GRIN objektivets prestanda är otillräcklig för en viss tillämpning, hybrid GRIN / sfärisk mål lins 9 eller miniatyr mål församlingar lins 10-11 kan utnyttjas.
Den högupplösta microendoscope beskrivs här i huvudsak fungerar som ett brett fält epi-fluorescensmikroskop, därför utan optisk sektionering (som i konfokala eller icke-linjära mikroskopi) är att vänta. Vår erfarenhet är att använda 455 ljus nm excitation och aktuella proflavine som kontrastmedel, är ljuset i första hand samlas in från ett djup som motsvarar ett par cellager.
Detta protokoll borde göra det möjligt för läsaren att montera den högupplösta microendoscope på bänk, med ett kompakt fotavtryck av 10 "x 8". Om så önskas kan systemet vara innesluten i en låda och elektriska komponenter (LED och kamera) drivs av ett batteri (figur 1d). Många kompaktkameror kan drivas av IEEE-1394 (Firewire) och USB-portar på värddatorn.
Disclosures
MP och dy har ingenting att lämna ut. RRK innehar patent för microendoscopic avbildning plattformar.
Acknowledgments
Denna forskning har delvis finansierats av National Institutes of Health, bevilja R01 EB007594, försvarsdepartementet Breast Cancer Research Program, förslag BCO74699P7 och Susan G. Komen Foundation 26152/98188972.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | |
| LED | Thorlabs Inc. | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Objective lens | Thorlabs Inc. | RMS 10X | |
| Tube lens | Thorlabs Inc. | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD |
| Condenser lens | Thorlabs Inc. | ACL2520 | |
| Cage cube unit | Thorlabs Inc. | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | |
| Cage rods and plates | Thorlabs Inc. | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | |
| Fold mirror unit | Thorlabs Inc. | KCB1, PF10-03-G01 | |
| Lens tubes | Thorlabs Inc. | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | |
| Adapters / couplers | Thorlabs Inc. | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | |
| SMA connectors | Thorlabs Inc. | SM1SMA, 11040A | |
| LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B TPS001 | |
| Fiber optic bundle | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |
References
- Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer. Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).
- Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope. Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).
- Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).
- Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring. Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).
- Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope. J. Microsc. 207, 108-117 (2002).
- Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle. Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).
- Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).
- Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope. Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).
- Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems. Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).
