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Neuroscience

小龙虾腹部肌肉受体机关：在本体的学生实验室练习

Published: November 18, 2010 doi: 10.3791/2323

Bonnie Leksrisawat*¹, Ann S. Cooper*¹, Allison B. Gilberts*¹, Robin L. Cooper*¹

¹Department of Biology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

Summary

本实验的主要目的是了解如何初级感觉神经元关节运动和岗位作为一种动物的本体信息传达的信息。本报告的另一个目标是目前解剖解剖，在解剖显微镜下观看的神经元的准备。

Abstract

本实验的主要目的是为了证明初级感觉神经元关节运动和岗位作为一种动物的本体信息传达的信息。这个实验的目的是学习准备的解剖结构，在解剖显微镜下染色，解剖和观察神经元和感觉结构。这是使用基本的神经电生理设备记录电活动的联合受体器官和染色技术。在小龙虾的肌肉受体的器官（MRO）系统是类似于哺乳动物梭内肌梭，艾滋病作为一个比较的模型，更易于访问的电生理记录。此外，这些都是识别的感觉神经元之间的准备工作。准备是可行的，这是对学生实验练习适合在一个小时的最小生理盐水。 MRO为也易患神经调节，鼓励行动的调节和整合运动和动态信号与系统中的一个可以改变增益静态位置的网站有趣的问题。

Protocol

1）引言

Proprioceptors是检测关节位置，方向，速度，和肌肉牵拉的神经元。本体是一个独特的感官的方式，因为proprioceptors interoceptors和刺激感身体内，而不是从外面的世界。

在脊椎动物的系统，它会出现许多的联合和紧张受体是没有必要的检测本体信息总值的。 annulospiral和flowerspray（感觉神经末梢）肌纤维的受体已消融以及振动和麻醉剂的研究显示本体需要两个基本受体组（Burgess 等人。检讨，1982年）。然而，值得注意的是，有其他受体，如在关节，精细的控制动作收集的冗余信息。像脊椎动物节肢动物挂接附属物。因此，这并不奇怪，为脊椎动物中描述的proprioceptors在节肢动物的肢体和关节。

解剖螃蟹chordotonal机关的安排，使每一个人的神经细胞的分析，根据功能。此外，发展问题可以得到解决，作为动物生长或动物时的再生肢体（1991年，库珀和Govind; Hartman和库珀，1993）。一些螃蟹联合chordotonal机关包含数以百计的初级感觉神经元（库珀，2008），这些神经元在关节的位置和运动的范围分馏监控方面。一个不太复杂的本体系统监测关节运动和立场是小龙虾的腹部肌肉受体机关（MROs）（埃克特，1961a，B;麦卡锡和Macmillan，1995）。小龙虾腹部MROs的机械感受器转导中嵌入肌肉的感觉神经末梢，成为一个分级的受体电位，舒展刺激。当潜在的超过阈值时，动作电位会导致轴突的基地。这是什么定义和穗启动“神经生物学”的网站。在这个系统中的细胞体驻留在密切同位监测的肌肉。存在两个不同类型的牵张感受器在这个感官系统：一个慢慢适应和迅速适应的受体。这次活动是依赖于机械拉伸强度。在小龙虾的MRO系统是类似于哺乳动物的梭内肌梭和肌肉也有传出的控制，保持在哺乳动物梭内肌的肌肉绷紧的性质。

在哺乳动物肌梭的感觉神经元是具有挑战性的electrophysiologically的感觉神经末梢的小性质进行调查，因为。在其周边的结局背根神经节细胞体的位置也很难跟踪。相比较而言，在小龙虾的MRO神经元易于长期录音细胞内外电极。 MRO的感觉神经元的胞体也比较大（直径在50-100微米）。在解决如何“舒展激活”通道在神经元的功能，离子流，渠道分销，和感觉神经元密度（Brown 等，1978年的模型， 爱德华兹等人，1981年;埃克斯莱本，1989年还担任感觉神经元;亨特等人，1978年Purali和Rydqvist，1992年; Rydqvist和Purali，1991年; Rydqvist和Swerup，1991年，Cooper 等人，2003年）。集成在一个段的MRO的感觉输入，可以影响其他毗邻段（埃克特，1961a，b）项。有感觉输入调制从几个报告的MRO（Pasztor和Macmillan，1990年，库珀等人，2003年）。调节神经回路是一个丰富的地区为基础科学的未来调查，可以作为该制剂在哺乳动物为未来的应用奠定了基础，可能在脊椎动物的脊髓（Rossignol等，2001年，2002年; Donnelan ，2009）

1.1）学习成果

在这个实验室实验，解剖小龙虾腹部，学习相关的解剖学和生理学的MRO。一是将学习如何监测与神经元的活动外录音，并使用普通的电生理设备。图和解释所获得的数据的基础上所提供的感官刺激。感官刺激，将范围从静态的立场，以及被监视的网段的动态运动。一是将解决这个感官系统的概念及其意义的本体感觉。感觉适应，将在一系列的实验观察。将讨论由学生的意义，以及感官适应背后的潜在机制。

2）方法

2.1）材料

法拉第笼

微操作机器人

吸电极

解剖显微镜

高强度照明灯（光源）

显微镜平台

差分放大器的AC / DC（AM系统公司型号3000）

PowerLab系统26T（公元仪器）

头阶段

LabChart 7（ADI公司的仪器，CO，美国科罗拉多州的斯普林斯，）

小龙虾盐水（MM：205氯化钠5.3氯化钾13.5氯化钙₂ .2 H _{2 O;} 2.45氯化镁₂ .6 H _{2 O} 5 HEPES调节pH值7.4）

亚甲蓝：这是小龙虾的盐水浓度为0.25％

Sylgard涂层菜（陶氏康宁; SYLGARD 184硅酮弹性体套件，MI美国道康宁公司，美联）

解剖工具

昆虫引脚

2.2）安装

图1：设备成立

安装了法拉第笼。显微镜，高强度照明灯，显微操纵器，盐水浴都将设立内笼（法拉第笼是用来阻止外部电场可能干扰与电气录音）。
安装在一个位置，它俯瞰显微镜阶段的显微镜。
高强度照明灯在方便的位置的位置。
在Sylgard菜准备使用小龙虾的盐水，盐水浴，放置在显微镜下（这是将被放置在解剖小龙虾腹部）。
定位在一个位置，吸电极容易获得的盐水浴显微。
吸起来生理盐水，直到它与银线内吸电极接触。排列吸电极靠近电极尖端切端线，使两条电线将盐水浴接触。
的AC / DC差分放大器（放大器）连接到电源实验室26T。通过适当的线连接，从输入PowerLab系统26T 1到放大器的输出。
- 放大器的仪器控制应设置以下设置：
  - 高通直流
  - 陷波器关闭
  - 低通- 20KHZ
  - 逆时针容量比赛.-
  - 直流偏移的精细和课程旋钮逆时针
  - 直流偏置（关） - 关
  - 增益旋钮- 50
  - 输入（DIFF单声道GND） - 差速器
  - 模式（刺激栅极REC） - 拍摄
  - ΩTEST- OFF
连接头阶段“输入探头放大器。
自吸电极连接的电线头阶段。导线应连接在左上角的红色（阳性），在中间绿色（地），黑（负底部，这是在图2表示。地线可以在盐水浴。

图2：主管级配置
现在笔记本电脑的USB线连接PowerLab系统26T。确保放大器和PowerLab26T插入并打开前开放的计算机上LabChart7。
打开LabChart7。
- LabChart欢迎中心中会弹出打开。关闭它。
- 点击安装程序
- 点击通道设置。渠道的数量更改为1（盒左下角），按下OK。
- 在图表的左上角设置每秒约2K的周期。伏特（Y轴）设置约500或200mV的。
- 通道1上按一下右边的图表。点击输入放大器。确保设置：单端AC耦合，并反转（反转的信号，如果需要的话），抗混叠，检查。
- 要开始录制按开始。

2.3）夹层

小龙虾（Procamarus克氏原螯虾 ）测量体长6-10厘米，应放在冰，麻醉开始前清扫动物。
从后面的爪子，用一只手握住麻醉的小龙虾。很快，削减从眼窝中间的头两侧，然后斩首小龙虾（注：从筹备的血液会被粘当它变干，所以洗的工具时完成）。

图3：小龙虾斩首
一旦小龙虾是斩杀，切之间的胸部和腹部的腹面（尾）。它应该很容易分开的胸部腹部。注：如果小龙虾是男性，削减STYLETS关闭之前分开的腹部和胸部（男性生殖部位）。（如下图4A所示）。
图4：腹部隔离
广场内的腹部，一剪刀的刀片和剪刀的技巧指向远离，沿外侧缘切开的准备。在另一侧重复上述步骤。

图5：纵向剥离腹部
拿镊子后端（＃3），推的肌肉和胃肠道远离背侧的准备。要确保不推肌肉。
（横向外侧）的最后一根肋骨上的剪切删除尾部腹侧。

图6：去除腹部的腹面部分
出现在小龙虾的盐水（修改后的范Harreveld溶液）的准备工作。
准备在显微镜下看，深伸肌内侧肌肉（DEM），可位于一个螺旋扭曲的纤维，和深伸侧肌肉与线性纤维，可以区分（见附件图1和2）。放置两个针在正中矢状地区DEM的肌肉之间的第一和第二肋骨（图7）腹部末端的一部分。

图7：安全准备记录包含维修的感官神经的神经。
将用于记录运行的角质层（图7），沿外侧缘旁的神经束。（这可能是必要的，以打击的准备，或拖放到盐水浴，使用滴管来查找它的运动神经）

注意：

每个腹节有两套迅速，慢慢适应左，右hemisegments MROs。相关的神经束沿着外侧缘旁的角质层。这是神经束，将录制。一个将无法查看MROs，因为他们正在位于警报1动作延迟时间和2肌肉（附录图1和2）。图8提供了一个以孤立的腹部解剖概述。

图8：一般夹层概述隔离腹部。 A，B和C是解剖小龙虾的一系列步骤。

3）结果

3.1）记录

图9描述了从缓慢和快速适应MROs同时拉伸和维护舒展获得的广义响应。在这次演习中，人会被记录来自MROs在一起，其轴突在相同的神经束中。

图9：小龙虾有两种类型的神经元在MRO 。阶段性的，这是由快速运动轴突和缓慢运动轴突支配进补支配。（一）当补药受体刺激慢慢适应刺激和动作电位的持续稳定的射击模式。（b）当一个阶段性的受体刺激迅速适应的刺激，只触发一个动作电位的短格局。

其中包含运动和感觉神经元的神经是整个记录（图10）。但将只检测电机驱动器已被切断腹神经索动物的感觉神经元。

图10
图10：神经束被吸进的记录电极。（一）免费神经漂浮在解剖腹部。（二）概述了由神经的神经束和吸塑电极接近。（三）节段性神经被拉入吸电极，这是在蓝色概述。

一个是现在准备记录MROs的电反应。

清扫范围的筹备工作，并准备录制成立。
电地面放置在洗澡和另一端的一个共同点的一个氯化银地线洗澡。注意：有时，这可能会导致在录制过程中的电气噪声。如果发生这种情况并不地面洗澡。
使用显微镜，找到要录制的神经
注：寻找最方便的神经段。神经是白色的，可以使用吸管周围神经的盐水喷雾或轻轻吹上的准备。这会导致神经走动，使得它更容易识别。
现在的神经已经确定的地方吸电极直接通过神经的显微操纵器（图10）。
轻轻拉动注射器上吸引到电极（可以看到被吸入电极显微镜的使用与神经）的神经。
按下启动按钮上Labscope7。
使用镊子轻轻移动的小龙虾的尾巴，并从180到45和90角度。请注意在每一个不同的角度的录音的区别。（改变角度的位置时一定要注意与相关的神经元活动在屏幕上的角度变化。，这是可以做到可以使用软件中的注释标记。）
响应的动作记录在下面的图表不同的静态运动。
- 保持在45 ° 15秒的小龙虾尾。
- 按下停止LabChart7屏幕上。记录的动作电位的发生，在最后录制的第二。
- 一分钟，保持在45 °的小龙虾尾。
- 按下停止LabChart7屏幕上。记录的动作电位的发生，在最后录制的第二。
说明：实验室图表屏幕上是一个移动的图形，是毫伏（Y轴）与秒（X轴）。措施，在一定的时间发生多少动作电位。它还措施伏的每一个动作电位或细胞外场电位的幅度。振幅是一个相对值，可用于确定是否存在细胞外记录的动作电位的不同大小的。外场电位记录的动作电位被称为“秒杀”。远离神经穗将较小。更宽松的吸电极接头较小的尖峰将作为当前是失去了与周围神经束的密封电阻和低的吸电极开放。

图1：

角（°）	＃1秒3秒后的动作电位	＃动作电位在1秒10秒后
180 °（平）

45 °

90 °

去思考，同时进行这些实验的问题是：是否有图案和一致的反应的延伸和关节的伸屈运动吗？寄托或持有的各种固定位置的尾节引起什么样的反应？是响应一致时反复？

请仔细观察反应的各种票据。你满意你的观察后，使这项活动的永久记录，保存的数据文件。一旦与你有段3中提出的意见表示满意，移动从4或5段的神经进一步的录音或上段3观察活动的另一侧。

不妨以确定是否神经调质（章鱼胺，羟色胺，proctolin等）或其他化合物或生理盐水离子性质的改变组成定义生理盐水获得的产生不同的反应。

3.2）与亚甲蓝染色

人们也许可以解剖出肌肉（见附件），以查看与染色技术MROs。以编制和倒入小龙虾的盐水了。亚甲基蓝溶液约5毫升放入准备，轻轻摇动几分钟菜。然后倒入废液容器过剩亚甲蓝和新鲜的生理盐水倒到准备。现在地方的菜，在显微镜下开始解剖肌肉查看MROs。沿肋骨（外侧正中矢状）剪刀放在肌肉下，拉起你沿着肌肉切，切段。一旦被切断的Del 1和2的肌肉，然后剥离肌肉背部和薄薄的肌肉层（SEM）应遵守。 MROs是最后两个内侧纤维躺在平行螺旋肌（图11）。

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图11：腹段的原理说明的肌肉群（A）和蓝色（B）有助于划定的肌肉群，在一个完整的准备与亚甲蓝染色准备。在B在A的概述面积扩大会议的看法。在B，警报1动作延迟时间和2个肌肉群不切掉，在原理图的下半部所示，在A所示

对于学生的练习，不妨有学生回答下列问题：

什么是interoceptive受体？
如何interoceptive受体与proprioceptors？
解释感觉适应和如何它可能涉及到这个实验室。
什么是范围分馏？是什么使中枢神经系统做呢？
录得阶段性或强直型神经元的神经元？为什么呢？
（提示：你会怎么假定运动神经元的活动看起来感觉神经元活动像在一个完整的动物）
在另一张纸上画一个小龙虾尾角与AP的频率图。
解释任何图中的趋势，你可能会观察

Discussion

为了充分记录在小龙虾的MRO 活动，在原地，在提供相关的电影和文字的细节提供了关键的步骤。我们的报告的目标之一是增加在该制剂的潜在的意识在学生调查实验室教授在感官生理学的基本概念。的筹备工作中的生存能力非常强大的，而正沐浴在最小的生理盐水。

电机控制的MRO肌肉已被确定，但在传输和突触可塑性以及潜力的兴奋和抑制性神经元的传输效果的调节仍然是一个开放的调查面积（Elekes和弗洛里，1987A，B，弗洛里和1955年，弗洛里; Kuffler，1954年; Kuffler和Eyzaguirre，1955年）。

该制剂可用于研究的实验条件下的数量以及范围内动物的自然运动，以便更好地了解生物学的主要研究以及示范目的的MRO。这些感觉神经元的生物物理特性已部分得到解决，他们适应的性质，在神经活动与保持刺激（Brown等，1978年，爱德华兹等人，1981年; Purali，1997年; Rydqvist和Purali，1991年; Rydqvist Swerup，1991年）。然而，只有少数报告对这些感受器的地址和相关的肌纤维（Cooper等人，2003年; Pasztor和Macmillan，1990）神经调节。只有少数的许多化合物是已知的血淋巴中的报告处理。许多调制器和调制鸡尾酒仍然要复杂的MRO（肌肉和神经元）检查。 Pasztor和麦克米伦（1990年）审查各甲壳类MROs的活动5 - 羟色胺和章鱼胺的神经调质，并指出，有不同物种。他们并没有详细研究这些神经调质的长期影响，也不对活动的影响，在不同的静态位置的MRO。

这种类型的准备，可以帮助了解感官知觉和调节神经处理，这是在人类与运动单位abnormities（Patel等人，2009年的康复和疾病管理的重要基础;。拉宾等人，2009年 ，圣马力诺等。 ，2010）。可用于输入和监测在访问无脊椎动物的准备关节运动的射击模式的各类机器人/假体（麦克米伦和Patullo，2001年）。还有许多问题，等候在此准备的答案，在许多方面可以。