Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

Summary

Bu protokol, verimli paralel açıklama ve plazmid DNA arıtma için uygun maliyetli bir alternatif

Abstract

Biz prokaryotik kültürünün başlangıç ​​ve yüksek saflıkta DNA ile biten, 96 plazmid hazırlıkları için AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar süreci tanımlamak. Bakteriyel lizat açıklık ve DNA saflaştırma için çok iyi filtrasyon dayanarak, bu yöntem plazmid hazırlanması için akıcı bir süreç oluşturur. Silika-tabanlı medya içeren Filtre plakalar, vakum filtrasyon veya santrifüj plazmid DNA kayda değer miktarda verim kolayca işlenebilir. Nicel analiz saflaştırılmış plazmid DNA 1.97 ortalama OD _260/280 oranları ile yüksek kalitede sürekli olarak belirler. Genel olarak, sıralama ve klonlama gibi downstream uygulamalar için daha saf DNA plazmid verim sunuyoruz. Aerodinamik AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar kullanarak bu yöntem, manuel, yarı otomatik veya tam otomatik işleme sağlar.

Protocol

1. Lizat Gümrükleme

1. E. büyütün Luria Broth 37 gecede uygun antibiyotik ile derin kuyu plakaları istenen plazmid DNA (kültür / iyi 1 ml) ° C sallayarak ile dönüştürdü coli kültürleri.
2. 10 dakika boyunca 5.000 xg'de kültür plakası Pelet E. coli, sonra süzün süpernatant.
3. 100 mcL Tekrar Süspansiyonu Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 mikrogram / mL RNaz A) her pelletini tekrar.
4. 100 mcL / iyi Lizis Buffer (200 mM NaOH,% 1 SDS) ekleyin ve 2 dakika boyunca plaka çalkalayıcı kullanarak sallamak.
5. 100 kuyu / mcL Nötralizasyon Buffer (3.0 M potasyum asetat, pH 5.5) ekleyin ve 2 dakika çalkalanır.
6. Açıklama plaka lizat hücre lizat aktarın.
7. 350 mcL toplama plakası ve vakum manifoldunun altına yeri üstüne yerleştirin DNA bağlayıcı plaka. (Bkz. Şekil 1) vakum manifoldunun birleştirin.
8. Elektrikli cihazların üstüne yerleştirin lizat açıklama plakası.
9. 10 inç Hg (0,34 bar) vakum uygulayın ve DNA bağlayıcı plakasına süzüntü toplamak. Hg in 12 daha büyük vakum kullanmayın. (0.41 bar).
10. Vakum manifoldunun sökün. Aparat altına yerleştirin 2 mL atık toplama plakası.

2. DNA Bağlama

1. (Bkz. Şekil 2) DNA bağlayıcı plaka manifoldunun üstüne taşıyın.
2. 300 mcL / iyi Bağlama Buffer (6 M Guanidin-HCl) ekleyin ve karıştırın ve aşağı yukarı pipetle.
3. Vakum uygulayın [~ Hg yavaş vakum inç 5 (0.17 çubuğu)] ve süzüntü atın. DNA membrana bağlı.
4. Yıkama Tamponu (80% Etanol) / iyi 400 mcL ile yıkayınız.
5. Vakum uygulayın, sonra süzüntü atın. 2 mL toplama plakası kullanılarak veya doğrudan atık filtreleme, gereksiz yere atın.
6. Tekrar bir kez yıkayın.
7. Leke alt kurumaya havluya filtre plaka.
8. Artık alkol kaldırılmasını sağlamak için 5-10 dakika bir kez daha vakum uygulayın.
9. Etanol damlacıkların kaldırılmasını sağlamak için alt kurutun.

3. DNA Elüsyon

1. 70 kuyu / mcL Elüsyon Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) ekleyin. Yüksek DNA konsantrasyonu isteniyorsa, hacim 50 mcL / iyi olabilir, ama ortalama toplam verim düşük olacaktır.
2. Plaka, bir dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Arıtılmış DNA ya vakum veya santrifüj tarafından yıkandı, olabilir.
4. Vakum yöntemi: Vakum manifoldu içine yerleştirin temiz toplama plakası (DNaz, RNaz ücretsiz). Tüm elüsyon tampon DNA bağlayıcı plaka geçti kadar vakum manifoldunun üstüne koyun filtre plakası, 15 inç Hg (0,5 bar) 1 dakika için vakum uygulamak. Saflaştırılmış DNA (bkz. Şekil 3) toplayın.
5. Santrifüj yöntemi: 5 dakika 1000 xg'de temiz toplama plakası ve santrifüj üst üste yerleştirin arıtma filtre plakası.

4. Nicel ve Nitel Analiz

1. OD _260/280 ölçün, saflaştırılmış DNA konsantrasyonu hesaplar.
2. Saflaştırılmış pDNA agaroz jel analizi gerçekleştirin.

5. Temsilcisi Sonuçlar

E. coli, malzeme başlayan enkaz kayda değer bir azalma gösterdi geleneksel santrifüj ve Pall AcroPrep Advance lizat açıklama Filtre Tabaklar kullanarak açıklık lizat . (Şekil 4).

Üç konsantrasyonlarda Plazmid DNA TE tampon içine çivili ve AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası üzerinden geçti. Plazmid DNA konsantrasyonunun karşılaştırılması, filtrasyon öncesi ve sonrası, gösteriler üç konsantrasyonlarda% 100 iyileşme (Şekil 5) ~.

Açıklık E. DNA kurtarma göstermek için coli lizat, plazmid DNA ham lizat çivili ve daha sonra filtrasyon ile duruluğu . Aynı plazmid DNA, hücre lizat aşağıdaki filtreleme eklendi. Elektroforez her bir örnek (Şekil 6) hacimde yapıldı. Her numune benzer şiddette bir tek, net bant filtreleme tabanlı açıklama adımı sırasında biraz varsa DNA kaybı göstermektedir.

Kültürler E. pCAT plazmid DNA içeren coli E. arınmış coli Pall Kullanıcı mcL 350 ve 1 ml DNA bağlayıcı Filtre Tabaklar, 350 mcL DNA bağlayıcı plakaların yanı sıra diğer iki marka lizatları. Üreticinin tavsiye ettiği protokolde belirtildiği gibi tüm arındırmalardan yapıldı. Yüksek DNA konsantrasyonu ve toplam verim Pall 1 ml AcroPrep Advance DNA arıtma filtresi plaka (Şekil 7 ve Tablo 2) görülür.

Rakip W yüksek DNA konsantrasyonu (155 ng / ml) göstermesine rağmen, toplam DNA verimi (4.7 mikrogram / iyi) düşük kurtarma hacmi nedeniyle düşük olduğu, ~ 30 mcL. Rakip M 108 DNA düşük konsantrasyon verdi ng / toplam 5.6 mg / iyi bir verim ile mcL.

Agarose jel üç farklı DNA bağlayıcı plakaları pCAT saflaştırılmış DNA analizi Şekil 8'de gösterilmiştir. Her toplanan numune hacmi elektroforez önce kurtarma hacmi farklılıkları düzeltmek için 65 mcL ayarlandı. Tüm numuneler plazmid DNA supercoiled gösterir, ancak her Filtre Tabaklar DNA verimi değişir.

Şekil 9 hazırlanan DNA supercoiled formu ve benzeri konsantrasyon gösterir.

Şekil 1. Lizat netleştirilmesi için vakum Manifold Meclisi.

Şekil 2. DNA Ciltleme için vakum Manifold Meclisi.

Şekil 3. Vakum Elüsyon için vakum Manifold Meclisi.

Şekil 4. Filtrasyon örnek açıklama kolaylaştırır. Vakum filtrasyonu (350 mcL AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası) veya geleneksel santrifüj açıklık ham lizat 300 mcL üç nüsha örnekleri. OD ₃₂₀ açıklama öncesi ve sonrası ölçülmüştür.

Şekil 5. PDNA AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası geçişi sonra tam iyileşme. 300 mcL TE tampon, 25, 50 ve 100 mikrogram / mL pCAT ile çivili. DNA konsantrasyonu ve kurtarma, K = 2 öncesi ve filtrasyon sonra OD ₂₆₀ hesaplanmıştır.

Şekil 6. Açıklama sonra pCAT DNA Kurtarma. Eşit miktarda, açıklama öncesinde veya sonrasında lizat içine çivili pUC19 sonra TE tamponunda 10 1 seyreltilmiş. % 1.2 agaroz jel üzerinde 2 mcL / şeritli yüklendi.

Şekil 7. Pall Acroprep Advance DNA rakip plakalar daha bağlayıcı filtre plakası ile ortalama Yüksek plazmid DNA verim 1 ml (Pall ve Rakip M) veya 1.5 mL (Rakip W) bir gecede kültürü ile gösterilir DNA arıtma plakaları kullanılarak pCAT plazmid DNA verimi (OD ₂₆₀₎ DH5α. Plaka üreticinin tavsiye protokolü kullanılarak saflaştırılması. Hata çubukları standart hata (n> 6) işaret etmektedir.

Şekil 8. PCAT DNA agaroz jel analizi belirtilen DNA bağlayıcı plaka saflaştırılmış. Saflaştırılmış pDNA% 1.2 agaroz jel elektroforezi. Örnekleri, üç ayrı arındırmalardan Pooled eluat arıtma, seyreltilmiş 01:10 sonra 65 mcL ayarlanır. Hat başına 2 mcL yüklendi.

Şekil 9. Kalite ve santrifüj veya vakum yöntemleri saflaştırılmış pDNA son eluat toplama agaroz jel elektroforezi için kullanılan benzer saf dna kurtarma. PDNA arıtma AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar için üreticinin tavsiye ettiği protokol izledi. Elüsyon, 2 dakika için 15 inç Hg (0,5 bar) ile 5 dakika veya vakum 1000 xg'de santrifüj tarafından yapıldı.

Discussion

Biz çeşitli avantajları tanıyor AcroPrep Advance Filtre Tabaklar facile, aerodinamik protokol açıklar. Bu yöntem, manuel, yarı otomatik veya tam otomatik AcroPrep Advance biçimlerde işlenmiş, maksimum plazmid DNA verim sağlar. Lizat açıklık plaka üzerinde entegre bir ön filtre örnekleri, hatta partikül bu içeren yüksek düzeyde tutarlı filtrasyon sağlar. , Daha hızlı, daha düzgün bir plaka üzerinde minimal tutma hacmi ile filtrasyon hızları plaka sonuçlarının iyi geometri ve çıkış uç geometrisi, çapraz kontaminasyon endişeleri olmaksızın alıcı plakasına doğrudan numune akışı sağlar. Önemlisi, AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar DNA bağlayıcı plaka yüksek bağlama kapasitesi membran yüksek kalite plazmid DNA maksimum kurtarma için optimize edilmiştir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157