Summary
وذكرت وإجراءات إعداد شرائح تحتوي على الكبار الماوس طائي التأقلم النواة (SCN) ، وسيلة سريعة للثقافة نسيج العقدة في حالة الثقافة عضوي النمط. علاوة على ذلك ، وصفت قياس متذبذبة على مدار الساعة التعبير الجيني البروتين الحيوي باستخدام التكنولوجيا مراسل luciferase.
Abstract
مركزية الإيقاعية (~ 24 ساعة) على مدار الساعة يوميا في تنسيق إيقاعات الفيزيولوجيا والسلوك يكمن في التأقلم النواة (SCN) وتقع في منطقة ما تحت المهاد الأمامي. مزامنة مباشرة على مدار الساعة من الضوء عبر شبكية العين والعصب البصري. تتولد من خلال التفاعل اليومي التذبذبات حلقات ردود فعل سلبية من عدد من ما يسمى "جينات الساعة" ومنتجات البروتين ، بما في ذلك الفترة (لكل) الجينات. الساعة الأساسية هي أيضا تعتمد على الاستقطاب الغشاء ، والكالسيوم ومخيم 1. اللجنة الفرعية للتغذية ويبين التذبذبات اليومية في التعبير الجيني على مدار الساعة ، والنشاط الأيضي والنشاط الكهربائي التلقائي. بشكل ملحوظ ، وهذا النشاط لا يزال مستمرا في دوري الذاتية شرائح أنسجة البالغين من العقدة 2-4. بهذه الطريقة ، يمكن بسهولة على مدار الساعة البيولوجية دراستها في المختبر ، مما يسمح للتحقيقات الجزيئية ، والكهربية والأيضية وظيفة جهاز تنظيم ضربات القلب.
اللجنة الفرعية للتغذية هو صغير ، واضحة المعالم بنية ثنائية الحق يقع فوق chiasm البصرية 5. في الفئران أنه يحتوي على خلايا عصبية ~ 8.000 في كل نواة ، ولها أبعاد ما يقرب من 947 ميكرومتر (الطول ، محور rostrocaudal) × 424 ميكرومتر (عرض) × 390 ميكرون (الارتفاع) 6. تشريح خارج SCN فمن الضروري خفض شريحة الدماغ على مستوى معين من الدماغ حيث يمكن التعرف على اللجنة الفرعية للتغذية. هنا ، نحن تصف الإجراء تشريح وتقطيع اللجنة الدائمة للتغذية ، الذي يشبه الفأر ولأدمغة الفئران. كذلك ، وتبين لنا كيف أن الثقافة تشريح الأنسجة organotypically على غشاء 7 ، وضعت لتقنية زراعة الأنسجة SCN بواسطة يامازاكي وآخرون 8. أخيرا ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام أنسجة معدلة وراثيا لقياس التعبير عن الجينات ساعة / البروتينات باستخدام التكنولوجيا الحيوية مراسل luciferase ، وهو الأسلوب الذي كان في الأصل يستخدم لقياس الإيقاعية التي Geusz آخرون 9. نستخدم هنا الأنسجة SCN المعدلة وراثيا من المغلوب في PERIOD2 : LUCIFERASE الفئران التي تنتجها يو 10 آخرون. الفئران تحتوي على البروتين الانصهار الفترة (PER) (2) والانزيم LUCIFERASE يراعة. عندما تتم ترجمة PER2 في حضور الركيزة لluciferase ، أي luciferin ، يمكن رصدها على النحو PER2 التعبير عندما luciferase تلألؤ بيولوجي يحفز أكسدة luciferin. عدد الفوتونات المنبعثة يرتبط بشكل إيجابي في كمية البروتين PER2 المنتجة ، وعلى ايقاعات تلألؤ بيولوجي ايقاع المباراة PER2 البروتين في الجسم الحي 10. ويمكن بهذه الطريقة يكون الاختلاف في التعبير دوري PER2 رصد مستمر في الوقت الحقيقي خلال عدة أيام. وقد بروتوكول نتبع لزراعة الأنسجة وتسجيل الوقت الحقيقي تلألؤ بيولوجي صفها بدقة من قبل يامازاكي وتاكاهاشي 11.
Protocol
1. حل التحضير
- مستنبت مع الهواء قدرة التخزين المؤقت
- ملء زجاجة 1 ليتر مع حوالي 800 مل العقيمة O 2 H (تعقيمها milliQ H 2 O).
- مع التحريك ، إضافة وخلط المواد التالية : 1 الغلوكوز الحاوية منخفضة ، ومصل خالية DMEM 2902 بدون مسحوق بيكربونات الصوديوم ، والفينول الأحمر (الفينول يتداخل مع الإشارة تلألؤ بيولوجي) ، و 20 مل B27 تكملة 50x و 4.7 مل من 7.5 ٪ NaHCO 3 حل (أو 0،35 ز NaHCO 3) ، و 10 مل HEPES 1M ، و 2.5 مل PenStrep 10000 U / مل و 3.5 غ مد الجلوكوز. ترك المتوسطة يحرك حتى تذوب تماما المكونات.
سوف المتوسطة النهائي (1 لتر) يحتوي على :
1X DMEM ، 1X B27 تكملة و 4.2 ملي NaHCO 3 ، 10 HEPES مم ، 25 U / البنسلين مل ، 25 U / الستربتوميسين مل و 19 ملي مد الجلوكوز. - ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 ، وذلك باستخدام هيدروكسيد الصوديوم لتقليل أو حمض الهيدروكلوريك لزيادة درجة الحموضة ، ويصل حجم ما يصل إلى 1 ليتر مع العقيمة O. 2 H
- ضبط الأسمولية مع H 2 O (الأسمولية النقصان) أو مد الجلوكوز (الأسمولية الزيادة). يجب أن يكون بين 285-315 الأسمولية mOsm / كغ ولكن مجموعة الأمثل هو 300-310 mOsm / كلغ. لا لتخفيف المتوسطة أكثر من 5 ٪.
- تصفية باستخدام مستنبت كورنينج الترشيح الفراغ العقيم مجموعات (مثل 2 × 500 مل مع حجم المسام 0.22 ميكرون) في غطاء العقيمة. إبقاء درجة مئوية في المتوسط (4) وحمايتها من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. من المستحسن أن يتم استخدام المتوسط في غضون 3 أشهر.
- هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) العازلة مع ملاحق (لقطع شرائح)
- ملء زجاجة 1 لتر مع مل العقيمة ~ 600 (تعقيمها milliQ) H 2 O وإضافة المواد التالية : 100 مل 10X HBSS الأسهم ، و 10 مل من البنسلين - U الستبرتوميسين 10000 / مل ، 5 مل من محلول 7.5 ٪ و3 NaHCO 10 مل HEPES 1M.
فإن الحل النهائي قطع تحتوي على :
1X HBSS ، 10 HEPES مم ، 4.5 مم NaHCO 3 ، 100 U / البنسلين مل و 100 الستربتوميسين يو / مليلتر. - فحص الحموضة ، وإذا لزم الأمر ، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 وتقديم ما يصل الى حجم 1 لتر العقيمة مع H 2 O.
- الأسمولية الاختيار ، والتي يجب أن تكون بين 285-315 mOsm / كلغ.
- تبريد HBSS إلى 4 درجة مئوية. المخزن HBSS يحتاج إلى بارد جدا (4 درجات مئوية) خلال تشريح / قطع الداخلي بغية اسقاط التمثيل الغذائي والحفاظ على سلامة الأنسجة.
- ملء زجاجة 1 لتر مع مل العقيمة ~ 600 (تعقيمها milliQ) H 2 O وإضافة المواد التالية : 100 مل 10X HBSS الأسهم ، و 10 مل من البنسلين - U الستبرتوميسين 10000 / مل ، 5 مل من محلول 7.5 ٪ و3 NaHCO 10 مل HEPES 1M.
2. التحضيرات قبل شرائح وقطع التثقيف
- يتم استزراع الأنسجة في غرفة جافة ودافئة دون CO 2. لتجنب جفاف الثقافات بحاجة إلى أن تكون مختومة مع تغطية النظارات التي تعلق على الأطباق التي الشحوم. لهذا الغرض ، وملء 5 مل المحاقن مع الشحوم فراغ سيليكون مقرا لها. تغطية نصائح المحاقن مع قطع صغيرة من رقائق الألمنيوم والأوتوكلاف لهم. أيضا ، الأوتوكلاف تصفية الأوراق (التي تستخدم أثناء تشريح الداخلي).
- الحق قبل التقطيع الداخلي ، وتطبيق تعقيمها الشحوم فراغ على سطح الحلبة أعلى من 35 ملم أطباق بتري. إعداد طبق بتري منفصلة لكل شريحة الثقافة.
- قبل البدء في إجراء تشريح جميع الصكوك غير معقمة ، شفرات حلاقة ، شفرات vibratome ، والنظارات وغطاء غيرها من المواد المستخدمة لهذا الإجراء شريحة والثقافة يجب أن تكون معقمة. رش جميع المعدات غير المعقمة مع الايثانول 70 ٪. فضح الصكوك وأطباق بتري مدهون مع الأشعة فوق البنفسجية في غطاء عن التعرض العقيمة لا يقل عن 30 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية قبل زراعة.
- في الوقت نفسه ، وملء أنبوب فالكون مع مستنبت الهواء التخزين المؤقت (العدد 1.2 مل لكل ثقافة ، لمدة 8 الثقافات تحضير المتوسطة مثيل مل 10) وإضافة luciferin إذابة طازجة (0.1 محلول المخزون M ؛ Promega ، ماديسون ، ويسكونسن) (10 ميكرولتر luciferin إلى متوسطة 10 مل ؛ التركيز النهائي 0.1 ملم).
- وluciferin خفيف الحساسة وحلول الأسهم على حد سواء والمتوسطة luciferin المحتوية على ضرورة أن تكون محمية من الضوء. وضع أنبوب مع فالكون luciferin المتوسطة في غرفة مظلمة 36-37 ° C التدفئة. إذا كان ذلك مناسبا ، ويمكن أيضا أن تضاف luciferin مباشرة في ثقافة الأطباق في وقت القطع. وأضاف إذا لم يتم luciferin ، لن يكون هناك رد فعل بين الضوء وluciferase luciferin وبالتالي عدم وجود إشارة من الأنسجة.
- بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، نعلق نصل إلى vibratome العقيمة.
3. SCN التقطيع الداخلي
يصف الإجراء التالي تشريح الكبار ، وعادة 2-4 أشهر من العمر ، C57/BL6 الفئران. يرجى ملاحظة ما يلي : إجراء القطع ، فضلا عن التعرض للضوء من الحيوانات أثناء الليل ، ويمكن إعادة بالتفاوت في مرحلة من العقدة. لتجنب ذلك ، ينبغي إجراء خفض زراعة وخلال ساعات الضوء ، ويفضل ZT بين 6-12 ، وعندما لا مرحلة جوهرية بسبب التحولات تحدث إلى إجراء 12. إذا كان لابد من SCN عينات في الظلام ، و 3.1 و 3.2 يجب أن يتم في ضوء أحمر أو مع نظارات الليل لتجنب مرحلة التحولات التي يسببها الضوء.
- تخدير الماوس يفضل isofluorane (باكستر) في GLASS الغرفة. عند الحيوان فقد المنعكسات آلامها (الاختيار بواسطة معسر مع المسامير في مخلب) لكنها لم توقف التنفس بعد (للحفاظ على امدادات الاوكسجين لأطول وقت ممكن) ، قطع رأس رئيس بسرعة مع زوج من مقص أو ما شابه ذلك.
يرجى ملاحظة : في بعض البلدان لا يزال يسمح CO 2 التعرض (hypercapnia) كطريقة مخدر ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن القلق لتعزيز الحيوان. بالإضافة ، قد يكون مطلوبا خلع عنق الرحم قبل قطع الرأس. يرجى اتباع التشريعات المحلية عند euthanizing الحيوانات. - إزالة العين من الرأس مع مقص لمنع التوتر والإثارة المزيد من الأعصاب البصرية ، والتي يمكن أن تلحق الضرر SCN.
- إذا كان ما زال مربوطا ، إزالة الفقاريات مشاركة عنق الرحم مع مقص ، وإزالة الجلد (الشكل 1A) ، وجعل اثنين من التخفيضات مع زوج من مقص غرامة (على سبيل المثال مقص القزحية) ، واحدة في قطع كل جانب من الجانبين على طول الجمجمة ، مما يجعل قابل للإزالة "غطاء".
- فتح الجمجمة بأداة مقراض الصغيرة (ويمكن أيضا غرامة مقص تشريح استخدامه على الماوس) ، وإزالة كافة العظام حتى يمكن رؤية بصيلات الشم. صعودا العمل ، لم تضغط باستمرار على الدماغ مع هذه الأداة ، من أجل منع وقوع أضرار في بطني SCN (الشكل 1B).
- قطع بعناية العصب البصري بين نصفي الكرة الأرضية والمصابيح الشمية في الدقيقة باستخدام مقص تشريح غرامة الربيع. تأكد من أن يتم قطع العصب تماما منذ يمدد من العصب البصري يمكن أن يؤدي إلى ضرر في اللجنة الفرعية للتغذية وشرائح تمزق.
- بدوره رئيس رأسا على عقب ، والسماح للدماغ سليمة تقع خارج (إذا كان لا يزال مربوطا إلى الدماغ والأعصاب القحفية الأخرى قد تحتاج إلى خفض عجزي في العصب البصري) في وعاء (على سبيل المثال طبق بتري زجاجي ≈ 10 سم) مملوءة 5-10 HBSS الباردة مل يسمح التبريد السريع للدماغ. من الناحية المثالية ، ينبغي أن الأعصاب البصرية two تبقى سليمة (الشكل 1C). إبقاء الدماغ 30-60 في الثواني HBSS للتأكد من أن تبريد الدماغ.
- استخدام الملعقة أو ما شابه ذلك ومكان الدماغ المبردة ، حتى السطح الظهري ، على سطح القطع معقم (على سبيل المثال طبق بتري الزجاج غطاء انقلب رأسا على عقب). من أجل إعداد قطع الاكليلية ، وجعل قطع متعامدة مع شفرات الحلاقة معقمة أو المشارط بين نصفي الكرة المخية والمخيخ ، وبالتالي إزالة المخيخ.
- تنطبق على منصة superglue الجافة التابعة لvibroslicer / vibratome.
- يلتقط الدماغ (نصفي المخ دون المخيخ ودون بصيلات الشم) عن طريق إدراج حادة ، ملقط المنحني في جزء منقاري والجافة بعناية قبالة HBSS على الورق مرشح العقيمة ، ما زالت تحتجز الدماغ مع ملقط. (بدلا من إدراج الملقط ، ويمكن استخدام قطعة صغيرة من الورق مرشح لتولي معقمة ونقل الدماغ).
- إصلاح الكرة الأرضية على منصة لصقها مع صعودا طرف منقاري والسطح البطني الأقرب إلى شفرة القطع. إرفاق منصة في حامل ينتمون إلى vibratome (على سبيل المثال من الآلات Campden ، المملكة المتحدة) وملء فورا مع HBSS الباردة. إذا تم قطع عمودي على الوجه الصحيح ، ينبغي أن نقف على التوالى بزيادة نصفي الكرة الأرضية وبالتالي توفير زاوية جيدة اللازمة لصنع قطع الاكليلية التي تحتوي على SCN الثنائية.
- من أجل الوصول إلى المنطقة المستهدفة SCN ، تبدأ بقطع سمكا المقاطع (500-800 ميكرون) من نصفي الكرة الأرضية بسرعة عالية أو الحد الأقصى للvibratome. ويمكن تحريك النصل تكون سريعة نسبيا في البداية قبل أن تصل إلى ما تحت المهاد ولكن ينبغي أن تباطأ عندما تصبح مرئية chiasm البصرية (الترددات العالية للشفرة تهتز وبطء الحركة أفقيا يقلل تلف الخلايا أثناء تشريح ، وبالتالي زيادة الجدوى شريحة). المقاطع للحد من 100 ميكرون عندما chiasm البصرية يصبح أكبر (أوسع) والصوار الأمامي يصبح أصغر. من أجل الحصول على المقطع منتصف العقدة ، والعمل لنفسك "أسفل" (اتجاه الذيلية) حتى نوى SCN two تبدأ في الظهور. قد تكون العدسة المكبرة اللازمة لوضع الرؤية والنوى. يرجى ملاحظة : يقع SCN في مخ الفأر أكثر من الذيلية chiasm البصرية مقارنة الدماغ الفئران.
- عندما تم الوصول إلى المستوى المطلوب من اللجنة الدائمة للتغذية (فإن العقدة عند هذه النقطة تبدو وكأنها أكثر تحديدا ، وهياكل على شكل دائري أو اللوز ؛ 1D الشكل ، ما يقرب من 0.46 - Bregma - -0.70 ملم لمنطقة وسط العقدة في الماوس 13 ، Bregma -- قطع 0.92 - -1.40 مم للفأر 14) ، والقسم SCN (الشكل 1E). سماكة مناسبة للشريحة هو الفأر 250 ± 50 ميكرومتر ؛ عن الفئران 350 ± 50 ميكرومتر.
- باستخدام فرشاة ناعمة ، ورفع ونقل شريحة SCN إلى غطاء من طبق بتري المتوسطة الحجم مملوءة HBSS الباردة ، وضعت تحت المجهر تشريح أو المجسام. الاختيار تحت التكبير إذا SCN الثنائية مرئيا بوضوح. إذا كان سيتم اختياره في منتصف منطقة SCN (والتي قد لا تكون بالضرورة "الأمثل" فقط بل على مستوى شريحة التي نعتبرها هي أسهل طريقة لتوحيد إجراءات تشريح وتقليل التباين) ، ينبغي ان ينظر اليها بشكل واضح على الأقل جانب واحد منشريحة المقطع. إذا كان خفض منقاري جدا ، وجعل قسم آخر والاختيار للSCN تحت التكبير.
4. عضوي النمط SCN الثقافة
- في طبق بتري غطاء مليئة HBSS ، تشريح خارج SCN الثنائية ونسيج مربع (~ 1.5 مم كل جانب) مع زوج من المشارط معقمة تحت المجهر تشريح. سوف تظل تعلق قطعة صغيرة من chiasm البصرية لازدراع ، ولكن ينبغي عدم إدراج أي نوى أخرى. قطع أقرب وقت ممكن دون إزالة الأنسجة SCN.
- إذا كان ذلك مناسبا لتجربة التخطيط ، ويمكن بعد ذلك أن تقطع SCN الثنائية في نصف للحصول على two SCN من جانب واحد. ويمكن بعد ذلك واحدة من جانب واحد SCN يمكن استخدامها لمكافحة (الشكل 2A).
- ملء 1200 ميكرولتر من الخطة المتوسطة الأجل luciferin في طبق بتري ≈ 35 مم ومكان غشاء الثقافة (الملة - CM 0،4 ميكرون ، ميليبور ، بيدفورد ، ماجستير) في أعلى سطح السائل (2B). حجم متوسط الثقافة هي الحاسمة ، والغشاء الثقافة يجب ان يجلس بأمان على قاعدة الطبق الثقافة ، لا تطفو أو صخرة في 11 المتوسط. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء تحت الغشاء. لا لزوم لها تجنب التعرض للضوء عند العمل مع luciferin.
- وexplants صغيرة ويصعب التقاط. بالتالي استخدام ماصة 1000 ميكرولتر + تلميح لامتصاص يزدرع SCN في تلميح واضغط عليه خارجا على الغشاء. في حال يزدرع كبير جدا لتناسب بسهولة في تلميح ميكرولتر ماصة 1000 (على سبيل المثال SCN الجرذ ، والفأر الثنائي SCN) قد يكون قطع رأس بأداة معقمة لخلق أوسع الافتتاح. تجاهل HBSS المفرط على الغشاء مع ماصة. لتسجيل luciferase ، ومكان واحد فقط SCN / طبق (الشكل 2B) وأنابيب تسجيل كشف جميع الفوتونات المنبعثة من صحن ولا تميز بين إشارات من الأنسجة المختلفة.
- ختم الطبق مع كوب تغطية (≈ 40 ملم ، منزل ، جلاسر ، ألمانيا) والشحوم فراغ (داو كورننغ كورب ، الولايات المتحدة الأمريكية) 11. تأكد من وجود ختم ضيق (الشكل 2C). إذا لم يكن كذلك ، مع أكثر ختم الشحوم.
- نقل إلى أطباق 36-37 ° غرفة ضوء محكم C - PMT والبدء فورا التسجيلات.
5. قياس نشاط Luciferase بواسطة ضوء بارد تسجيل
يتم الكشف عن اشارات تلألؤ بيولوجي Luciferase الناجم من النسيج العقدة الصغيرة وتضخيمها مع photonmultiplier أنبوب المجالس كاشف (PMT) منصة داخل الحجرة الضيقة الخفيفة. وتتمركز هذه الفرق عادة ~ 1-2 سم فوق أطباق ثقافة 8. يمكن أن تكون الاجهزة تسجيل PMT العرف أو متوفرة تجاريا 11.
- وضع صحن تحت PMT (الحرارة الناتجة من PMT سيزيل التكثيف على زجاج الغطاء) ، وإغلاق الغرفة. تأكد من أن الغرفة 100 ٪ خفيفة مشددة حيث عدد المظلم من هذه الفرق تستخدم لأنسجة SCN منخفضة جدا (أقل من 20 الفوتونات / دقيقة). وكشف عن هذه الفرق حتى أضعف تسرب الضوء.
- بدء الحصول على البيانات ، والتي تتم مع برنامج (على سبيل المثال LumiCycle ؛ Actimetrics شركة ، ويلمت ، IL ، الولايات المتحدة). تتكامل التهم الفوتون على فترات 1-10 دقائق للحصول على دقة عالية في التعبير الجيني / البروتين.
- بعد الانتهاء من التسجيل ، ويمكن الحصول على تحليل التعبير الإيقاعية من الجين / بروتين مع البرمجيات المناسبة (المنشأ ، OriginLab ، نورثهامبتون ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ ClockLab ، Actimetrics ؛ LumiCycle ، Actimetrics المؤتمر الوطني العراقي ؛ كرونو ، حتى Roenneberg ، جامعة ميونيخ ، ميونيخ ، ألمانيا) لتحديد المرحلة ، الفترة (الوقت المناسب لدورة واحدة) والسعة من الإيقاع. غالبا ما يستخدم تعبير ذروة الجين أو البروتين كنقطة مرجعية وتعرف بأنها أعلى العد فوتون خلال دورة واحدة. ويمكن تلطيف تحليلات البيانات قبل فترة ، والسعة المرحلة ، خاصة إذا كانت نسبة الإشارة / الضجيج منخفضة. الأساس يتغير في بعض الأحيان ، وتحتاج إلى طرح قبل أن يتم إجراء التحاليل.
6. ممثل النتائج :
نقدم هنا PER2 متذبذبة : لوك التعبير بوصفها تلا لسلامة وحالة الأنسجة المستزرعة. في الظروف المثالية ، وإذا كان النسيج لا يزال حيا ، وPER2 : لوك التعبير تتأرجح مع إيقاع الساعة البيولوجية كما هو مبين في الشكل 3. وأعرب عن الحد الأقصى PER2 في SCN عادة حوالى الساعة Zeitgeber 12-13 (حيث يمثل 12 ZT الأنوار في ساعة 12:12 الخفيفة : المرحلة المظلمة). الأكبر في حجم الأنسجة الحية ، وارتفاع عدد الفوتون يصبح. ومع ذلك ، ينبغي أن يوضع في حجمه وسماكة الأنسجة مثقف organotypically الصغيرة من اجل الحفاظ على النسيج قابلة للحياة ، ويفضل أن لا يزيد حجمه عن 15 مم 2 11 وليس أكثر سمكا من 500 ميكرون 7. اللجنة الفرعية للتغذية ، إذا تشريح كما هو موضح هنا ، ويظهر عادة بين التهم الفوتون 10.000-40.000/min إذا تم أخذ عينات من أنسجة من PER2 متماثل : لوك الحيوانية. سعة التذبذب في الثقافات SCN عضوي النمط هو عادة مرتفعة جدا خلال الدورة الأولى ، مقارنة مع الدورات التالية. ليس من الواضح تماما لماذا دورة الأولى التي amplit عالية جداأودي. أحد التفسيرات المحتملة هو أن جزءا كبيرا من الخلايا في الأنسجة قد يموت بعد فترة قصيرة من القطع الأولية والتثقيف ، وبالتالي عدم استخدام luciferin بعد الدورة الأولى. قد تتسبب أيضا في إجراء خفض الإثارة المفرطة ، التي يمكن أن تضخيم إشارة luciferase خلال الدورة الأولى.
الشكل 3 تظهر آثار التلألؤ من شرائح SCN ويحتوي على واحد التتبع (الحمراء) التي تم الحصول عليها من شريحة التي كانت في البداية غير صحي. الأنسجة الميتة أو غير صحي وانخفاض عدد خطوط الأساس الفوتون. (بالإضافة إلى ذلك ، كثيرا ما تنأى أنسجة ميتة في طبق والتي لا يمكن إزالتها من الغشاء في قطعة واحدة).
يمكن الانتفاع تقنية وصفها في هذا التقرير أن تستخدم في التجارب الدوائية. الشكل 4 يوضح تتبع من ثقافة أننا تعامل بين يوم 1 و 2 مع حاصرات قنوات HCN (ZD7288 ، 10 ميكرومتر). كما يمكن أن يرى في الشكل وكما نشر سابقا 15 ، مانع خفض كبير في سعة من التذبذب اليومي من PER2 ، ولكن بعد غسلها خارجا مع مستنبت طبيعي عاد التذبذب ، مما يدل على أن مانع أثرت على مدار الساعة الجزيئية ولكن وكان نسيج وقابلة للحياة صحية.
الشكل 1. تشريح الداخلي
أ) رئيس ماوس مقطوعة الرأس مع الموت الرحيم العينين والجلد إزالتها. B) هو إزالة الجمجمة بأداة مقراض الجزئي. عند استخدام هذه الأداة ، يجب على المرء العمل صعودا وأبدا اضغط لأسفل الدماغ مع الأداة. C) الدماغ أظهرت رأسا على عقب (بطني حتى الجانب) من دون بصيلات الشم. يمكن رؤية تصالبة البصرية الأبيض مع الأعصاب البصرية two سليمة. وتقع النواة التأقلم (SCN ، الحدود التي تحمل علامة حمراء) على مقربة من chiasm البصرية. D) دماغ خفض coronally تعلق على منصة في vibroslicer ، على مستوى اللجنة الدائمة للتغذية. E) القسم الدماغ الاكليل (250 ميكرون سميكة) تحتوي chiasm البصرية (OC) ، والثالثة البطين (3V) والثنائية النواة التأقلم (SCN).
الشكل 2. زراعة نسيج عضوي النمط.
أ) وهما نواة SCN من جانب واحد (إدراج) من تشريح شريحة يظهر باء) طبق الثقافة (35 طبق بيتري ملم) مع غشاء ثقافة والمتوسطة ويزدرع ، ولكن دون الشحوم فراغ والزجاج غطاء. ويمكن النظر إلى المتوسط (1.2 مل) ، وبين السائل والطبق غشاء. يوضع على نواة واحدة من جانب واحد SCN على الغشاء الثقافة. وبياضا جزءا من النسيج الصغيرة هو قطعة من chiasm البصرية (إدراج). C) الطبق الثقافة مع الغشاء ونسيجه SCN ، ممهورة الشحوم فراغ والزجاج تغطية الجولة.
الشكل 3. تسجيلات من تلألؤ بيولوجي صحي وغير صحي الثقافات الأنسجة SCN.
أمثلة من التسجيلات من تلألؤ بيولوجي PERIOD2 : LUCIFERASE (PER2 : لوك) التعبير في التأقلم النواة (SCN) شرائح تم الحصول عليها من الفئران التي عقدت في 12H : 12H ضوء : دورة الظلام. وPER2 : لوك البروتين تتأرجح مع اختلاف (~ 24 ساعة) الإيقاعية التي التعبير إلى أقصى حد من البروتين يحدث في وقت Zeitgeber 12-13. وبالتالي ، فإن المرحلة من إيقاع الجين يعتمد على الجدول الزمني للضوء في الظلام الذي كان يحتفظ الحيوان قبل التضحية. عادة ، تلألؤ بيولوجي من جانب واحد من الأنسجة SCN تشريح كما هو موضح في بروتوكول يوضح التهم بين الفوتون 10.000-40.000/minute ~. ويوضح الشكل آثار من ثقافة صحية SCN (أسود) ، ثقافة واحدة SCN غير صحية (الحمراء) ، وثقافة واحدة العقدة التي جفت (الأزرق) بعد افتتاح الطبق الثقافة مختومة في اليوم (4) وليس إعادة ختم طبق بشكل صحيح ( وأشارت بواسطة السهم).
الشكل 4. تسجيل تلألؤ بيولوجي أثناء وبعد التعرض للمخدرات.
PER2 : لوك التعبير في الثقافة قبل وأثناء وبعد العمل لحاصرات قنوات HCN (ZD7288 ، 10 ميكرومتر). السهم الأول يشير إلى الوقت الذي تم إضافة مانع. السهم الثاني يشير إلى فشل ، والذي تقدم عن طريق استبدال المخدرات التي تحتوي على المتوسط مع سيطرة مكيفة المتوسطة. لاحظ انخفاض السعة بعد 2 أيام من التعرض للمخدرات ، وعدم التذبذب في اليوم (4) والشفاء العاجل للإيقاع البروتين بعد انخفاضه.
Discussion
منافع ومساوئ التكنولوجيا مع مراسل luciferase
على النقيض من الأساليب فيفو السابقين ، مثل RT - PCR ، التهجين في الموضع وصمة عار الغربية التي تتطلب أخذ عينات الأنسجة في العديد من النقاط الزمنية المختلفة (إعطاء القرار وقت انخفاض ساعات 2-4 عادة اعتمادا على وتيرة أخذ العينات) من أجل دراسة نهاري الاختلافات في التعبير عن الجينات والبروتينات ، والتكنولوجيا مراسل luciferase يسمح عالية الدقة (1-10 دقيقة) دراسات التذبذبات الإيقاعية لعدة أيام في إعداد نفسها. دراسات وهكذا ، يتم تصغير عدد الحيوانات المستخدمة ومفصلة للتأثيرات على مرحلة وفترة ممكنة الإيقاع ، والتي عادة لا يمكن استخدام تقنيات أخذ العينات التقليدية مع القرار مرة منخفضة. لكن ، على الرغم من قياسات السعة النسبية للإيقاع ممكنة ، ينبغي التأكيد على أن التكنولوجيا مراسل ليس الكمية وبالتالي لا يمكن استخدامها لقياس كميات من الجينات المتحولة أو البروتينات ترجمتها.
يمكن بدء التسجيلات تحليل الأنسجة ومباشرة بعد زراعة ، وهي ميزة كبيرة لدراسة آثار مباشرة في الضغط الجزيئي للالحية ، في ضوء التحولات فيفو المرحلة التي يسببها إلخ الثقافة SCN عضوي النمط يسمح على المدى الطويل (أسابيع) التلاعب الدوائية من الدماغ الكبار الأنسجة التي تحتوي على شبكة سليمة متشابك نضجا والتكنولوجيا مراسل luciferase يسمح التسجيلات مستقرة لعدة أسابيع. وبالتالي ، فإن الأنسجة لا تحتاج إلى أن يكون الولدان بعد الولادة أو في وقت مبكر من أجل الحصول على ثقافات صحية ، وعلى النقيض من العلاجات الدوائية شريحة الحادة المزمنة يمكن أن يؤديها. على النقيض من البلازميد ، مراسل transfections في مزارع الخلايا ، والتي لا تؤدي إلى أي دمج الحمض النووي في الجينوم ، والمعدلة وراثيا luciferase الحيوانات النماذج (وكذلك transfections lenti الفيروسات) مواتية إذا تعديلات جينية هي التي يتعين دراستها. وينبغي في هذا السياق أيضا يمكن الإشارة إلى أن التصوير التلألؤ في الوقت الحاضر هو ممكن مع اتفاقية مكافحة التصحر كاميرات حساسة للغاية 11 ، والسماح التسجيلات حتى في الخلايا العصبية SCN واحدة (~ 60-10 ميكرون) ، وأنواع الخلايا الأخرى ، والتي تستخدمها المختبرات الكبرى تدرس ايقاعات كل يوم. أخيرا ، والمحققين عادة ما تستخدم عدة الإيقاعية رصد الجزيئي باستخدام التعبير للصحفيين الأخرى ، مثل البروتين في نيون الخضراء ، من أجل دراسة الجينات ساعة / التذبذبات بروتين 16-19.
جوانب شريحة سمك
يمكن تخفيض سمك الموصى بها هنا للشريحة SCN (200-300 ميكرون) ، أو زيادة الرغبة. ومع ذلك ، على الرغم من أن الأنسجة مسطحا على الغشاء بعد بضعة أيام في الثقافة ، فمن غير المستحسن أن تتجاوز 500 ميكرومتر من سمك شريحة قطع في البداية من أجل الحفاظ على سلامة النسيج 7. أرق شريحة من 100 ميكرون هو من الأسباب الميكانيكية والعملية من الصعب التعامل معها. لأن الأنسجة غير المتجانسة SCN سمك شريحة قد تؤثر على مرحلة من مراحل الانتاج إشارة luciferase ، لأن المناطق المختلفة داخل SCN (على سبيل المثال "الأساسية" في مقابل "وهمية" ، والمناطق الظهرية مقابل بطني) التأرجح مع مختلف مراحل 20 و تفاضلي إعادة مزامنة بعد مرحلة تحولات القرن 21. سمك شريحة يؤثر أيضا على خط الأساس لعدد فوتون منذ أكثر الأنسجة تنبعث منه أكبر عدد من الفوتونات. بهذه الطريقة قد اتساع الاهتزازات الجزيئية تتأثر بشكل غير مباشر على حجم ازدراع. لهذه الأسباب ، ينبغي أن تحكم والثقافات المعالجة تكون دائما من نفس السمك والحجم والتي تحتوي على نفس المنطقة من اللجنة الدائمة للتغذية من أجل التأرجح في المرحلة نفسها ، والسعة مع نفسه. نواة two من جانب واحد ، من ناحية أخرى ، تتأرجح في مرحلة مع بعضها البعض ومع سعة مماثلة طالما vibratome قطع أفقي وليس الزاوية (والتي هي بدورها تعتمد على أن الفصل بين قطع المخيخ ونصفي الكرة الأرضية هو عمودي على سطح الطاولة). قد محقق الذي يؤدي استزراع SCN التجربة أن الثقافات SCN لا تتذبذب في مرحلة مع بعضها البعض. ممارسة وتوحيد أسلوب التقطيع ، أي تقطع دائما على مستوى شرائح rostro - الذيلية نفس اللجنة الدائمة للتغذية ، وسوف تحسين النتيجة.
خطوات حاسمة
- امدادات الاوكسجين أمر بالغ الأهمية.
لأن الدماغ يتطلب الكثير من الأكسجين 22 ، إجراء تشريح يحتاج إلى أن تكون سريعة (وكلما 3،1-3،10 هو 5-6 دقائق ~ كلما كان ذلك أفضل من أجل الحفاظ على الأنسجة السليمة). - اللجنة الفرعية للتغذية حساس للتغيرات في درجة الحرارة وتبادل المتوسط.
اللجنة الفرعية للتغذية حساس درجة الحرارة والتغيرات في درجات الحرارة يمكن أن مرحلة التحول الكبير في تنظيم ضربات القلب ويسبب القطع التجريبية 23. إذا كان يتم تبادل متوسطة أو الحلول أو وأضاف خلال تجربة الجارية ، على سبيل المثال عند تطبيق المخدرات بعد بضعة أيام في الثقافة والمتوسطة أو محلولن يجب أن يكون مسبقا لحرارة 36-37 درجة مئوية (في نفس درجة حرارة في الغرفة) قبل الإضافة. في التجارب الدوائية التي تنطوي على تبادل المتوسطة ، فمن المهم دائما للعمل مع الخلية قبل مكيفة متوسطة الثقافة. إضافة / غسل خارجا مع الطازجة والمتوسطة يمكن أن تحول دون شروط ، المرحلة يحتمل الإيقاع SCN 24 الجزيئية فضلا عن غيرها من الثقافات نوع من الخلايا 25. - متوسطة التكوين.
من المهم أن الثقافة في نسيج الحموضة الصحيح والأسمولية. المتوسط الجوية التخزين المؤقت يحتوي على كمية كبيرة من HEPES ، التي لديها القدرة العازلة الأمثل في نطاق 6،8-8،2 درجة الحموضة ومناسب أيضا لدرجة الحموضة التخزين المؤقت التغييرات التي قد تحدث نتيجة للتنفس الخلية. HEPES ، من ناحية أخرى ، أكثر حساسية لتغيرات درجة الحرارة مقارنة مع بيكربونات الصوديوم ، والتي يتم تضمينها في كميات صغيرة في المتوسط الثقافة. بيكربونات الصوديوم لديها قدرة أكبر على التخزين المؤقت في الجزء الأسفل من الرقم الهيدروجيني (5،1-7،1) مجموعة 26 ، وبالتالي المناسبة في جو 2 CO. ومع ذلك ، زادت كميات من بيكربونات الصوديوم في الهواء المتوسطة التخزين المؤقت (DMEM 2902) يزيد بشكل ملحوظ والأسمولية لا يمكن إضافتها في وقت واحد دون تمييع المتوسط ، والتي تؤدي بدورها في تكوين غير صحيح من الأمينية الفيتامينات والأحماض والأيونات.
نصيحة لإعداد المتوسط :- يكون دقيقا وحذرا عند خلط المتوسط.
- استخدام الحلول الأسهم الطازجة فقط أو إذابة حديثا.
- في حالة الأسمولية عالية جدا لا يستحق تمييع. وسوف أكثر من 5-6 ٪ ، المخفف المتوسط المرجح عدم العمل. استخدام D - غلوكوز لزيادة الأسمولية إذا كانت منخفضة جدا.
- مرحلة التحولات بسبب الوقت اللازم لإعداد
وقت إعداد شريحة أمر بالغ الأهمية. يتم الحصول على الحد الأدنى من الصفر أو تأثير على المرحلة إذا تم تنفيذ الإجراء شريحة بين 6-12 ZT 12. يجب أن يتم تنفيذ جميع تشريح شريحة في المرحلة نفسها من الدورة النهارية أو الإيقاعية من أجل تقليل الخطأ بسبب التفاوت بين مرحلة التحضيرات.
التعديلات الممكنة
- لالكهربية SCN الحادة ، وتشريح لابد من تنفيذها مع رينغر (السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي ؛ ACSF) العازلة ، ومشبع بالأكسجين (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) ، قبل ان يبدأ تشريح. مزيد من الأوكسجين الاحتياجات التي يمكن ان تضاف باستمرار إلى المخزن المؤقت أثناء إجراء تشريح كامل ، حيث أن النشاط الكهربائي ومتشابك يعتمد مباشرة على امدادات الاوكسجين 22.
- ويمكن أيضا شرائح أفقية والسهمي تكون مستعدة بنجاح والمثقفين من العقدة. الكتاب لديهم خبرة في التسجيلات luciferase شرائح أفقية ، والتي وفقا لخبرتنا تعطي التذبذبات الإيقاعية مع انخفاض السعة بالمقارنة مع خفض الاكليلية.
- اللجنة الفرعية للتغذية ما يقرب من 1 ملم طويلة rostro - caudally واستهدفت تقنية التقطيع وصفها هنا من أجل الحصول على مقطع SCN في المنطقة الوسطى. ومع ذلك ، يمكن الحصول على أكثر من مقطع واحد من SCN الماوس وأدمغة الفئران ، والسماح للتحقيق في التعبير الجيني / البروتين الإيقاعية في مستويات أكثر منقاري مقابل الذيلية للنواة SCN.
- ويمكن أيضا الثقافات شريحة أصغر سنا من الحيوانات ، والجراء بعد الولادة أو حتى الأجنة ، ويكون مستعدا. يرجى ملاحظة أن الدماغ في جمجمة والجراء الصغار جدا وناعمة جدا وحساسة. بالإضافة إلى ذلك ، في العصب البصري هو رقيق وليس تطويره بالكامل. أخذ الحذر عند تشريح الدماغ من الجراء حتى لا تلف المنطقة SCN. على سبيل المثال ، لا يمكن الصغرى مقراض أدوات يمكن استخدامها لفتح الجمجمة من الجراء الماوس لأنها كبيرة جدا. مقص الغرامة تكفي لقطع الأنسجة الناعمة في الجراء الصغار.
- ويمكن أيضا تغطية تقنية الزجاج ثقافة تستند صفها هنا يمكن استخدامها لالتلألؤ الصورة باستخدام كاميرا CCD / EM - CCD ، وأيضا في الخلايا العصبية SCN واحد.
- المركزية الاخرى في مناطق الجهاز العصبي والأنسجة الطرفية من الجهاز PER2 المعدلة وراثيا : يمكن للحيوانات يمكن الحصول عليها بسهولة لوك ، مثقف وتحليلها من حيث التذبذبات الجزيئي ، كما PER2 : لوك التعبير لا تزال تتأرجح لعدة أيام أيضا في عدد من الأنسجة الأخرى أنواع الخلايا و 10. معظم هذه الأنسجة الطرفية ، على سبيل المثال الكبد ، لا تتطلب غشاء من أجل البقاء ولكن بدلا من ذلك المثقف استحم مباشرة في 11 المتوسط. يرجى ملاحظة أن مرحلة التحول بسبب sectioning ، زراعة وتبادل المتوسطة قد لا تتبع نفس المبادئ للجنة الدائمة.
أهمية
الماوس في الفئران المعدلة وراثيا وسلالات (mPER2 : لوك ؛ mPer1 لوك 8 ، 10 ، 27) luciferase يعكس نشاط انزيم البروتين أو الإيقاعات والتعبير الجيني يمكن تقييمها من خلال تسجيل تلألؤ بيولوجي. وتلألؤ بيولوجي luciferase المولدة يعطي إشارة ضعيفة ولكن التألق خلفية قريبة من الصفر ، مما يجعل هذه الطريقة مفيدة. وعلاوة على ذلك ، لأن جزيء luciferase غير مستقرة تتحلل بسرعة وليس هناك فتاهتسميم أذني ، والتي يمكن أن تظهر خلال فترة طويلة الأجل إنارة مثير 28. أخذت معا ، هذه الخصائص تسمح للتجارب طويلة الأمد مما يجعل هذه التكنولوجيا مراسل luciferase مفيدا للغاية في مجال البحوث الإيقاعية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية السويدية (K2009 - 75SX - 21028-01 - 3 ، K2008 - 61X - 20700 - 01 - 3) ؛ FONCICYT 000000000091984 ؛ أسس Jeansson ، Söderström sjukhemmet Königska ، Lundqvist مارثا وسيجورد إلسا اوتش Goljes Minne ، والجمعية السويدية للطب SLS - 95151. مع التقدير والإمتنان أستاذ الجينات دال بلوك ، جامعة كاليفورنيا ، للتعليق على مخطوطة ثمينة. نشكر الدكتور مايكل اندانج والدكتور Johard هيلانة لحاصرات قنوات HCN ، والأستاذ عبد السيد Manira من أجل توفير المجهر الفيديو.
الاعتبارات الأخلاقية :
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها ومعهد كارولينسكا "في ستوكهولم Norra Djurförsöksetiska Nämnd". يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات مع نية للحد من أي إزعاج أو الضغط الممكنة للحيوان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Cover glasses | Menzel-Glaser | 40#1 | ≈ 40 mm |
| Culture membranes | EMD Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma-Aldrich | D2902 | Powder for 1L |
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | ≈ 55 mm |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μmPolyethersulfone |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 |
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | 100 ml |
| HBSS 10x | Invitrogen | 14065-049 | 500 ml |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen | 25080-060 | 50 ml |
| Luciferin | Promega Corp. | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | |
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen | 15140-122 | 100 ml |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm |
| PMT | Hamamatsu Corp. | H9319-11MOD | |
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 09-761-5 | |
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | |
| Vibratome | Campden Instruments |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
