Summary
Diese Methode beschreibt die Erzeugung von organotypischen Kleinhirn Kulturen und die Wirkung bestimmter apoptotischen Stimuli auf die Lebensfähigkeit der verschiedenen Zelltypen des Kleinhirns.
Abstract
Organotypischen Kulturen von neuronalen Gewebe wurden zuerst von Hogue 1947 1,2 eingeführt und war ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Seitdem wurde die Technik weiter entwickelt und derzeit gibt es viele verschiedene Möglichkeiten, um organotypischen Kulturen vorzubereiten. Die hier vorgestellte Methode wurde von der von Stoppini et al angepasst. Für die Vorbereitung der Scheiben und von Gogolla et al. Für die Färbung 3,4.
Ein einzigartiges Merkmal dieser Technik ist, dass man auf verschiedene Teile des Gehirns wie Hippocampus oder Kleinhirn in ihrer ursprünglichen Struktur Studium ermöglicht und bietet einen großen Vorteil gegenüber dissoziierten Kulturen, in denen alle zellulären Organisation und neuronale Netzwerke gestört werden. Im Falle des Kleinhirns ist es noch vorteilhaft, weil sie das Studium der Purkinje-Zellen, äußerst schwierig, wie distanziert primären Kultur erhalten können. Diese Methode kann verwendet werden, um bestimmte Entwicklungsstörungen Funktionen des Kleinhirns in-vitro-Studie, sowie für die elektrophysiologischen und pharmakologischen Experimente sowohl in Wildtyp-und mutierten Mäusen werden.
Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Wirkung von apoptotischen Stimuli wie Fas-Ligand in den Entwicklungsländern Kleinhirn Studie mit TUNEL-Färbung zur Apoptose zu messen. Wenn TUNEL Färbung mit Zelltyp spezifische Marker, wie Calbindin für Purkinjezellen kombiniert wird, ist es möglich, den Zelltod in einer Zellpopulation gezielt auszuwerten. Die Calbindin Färbung dient auch dem Zweck der Beurteilung der Qualität des Kleinhirns Kulturen.
Protocol
1. Organotypische Cerebellar Cultures:
- Um erfolgreich zu generieren organotypischen Kleinhirn Kulturen verwenden Mäusen zwischen P0-P3 oder P8-P12. Für unser Experiment benutzten wir Mäuse in der P8-P12 Bereich, weil dieser Entwicklungsstufe war besser geeignet für unsere Studie.
- Bereiten Sie die Präparation und das Kulturmedium:
- Brain-Dissektion und in Scheiben schneiden Zubereitung sind in niedrigen Natriumgehalt Artificial Liquor (ACSF) mit 1 mM Calciumchlorid, 10 mM D-Glucose, 4mm Kaliumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 26mm Natriumbicarbonat, 246mm Saccharose und Phenolrot-Lösung (1:1000) durchgeführt , pH 7,3. Zu sterilisieren die Lösung, zu filtern durch eine .22 um Filter und lagern bei 4 ° C.
- Zerebelläre Scheiben sind in 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum, 25mm HEPES, 1 mM Glutamin, 5 mg / ml Glucose, Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 U / ml) kultiviert. Filter das Medium durch ein 0,22 um-Filter und lagern bei 4 ° C für maximal zwei Wochen.
- Dissect Gehirn in eiskaltem ACSF Medium zuvor mit Carbogen (95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid) Hinweis sprudelte, wird diese Sättigung mit Carbogen Änderung des pH-Wertes der Lösung so aus rot bis orange werden sich verschieben. Die Dissektion sollte im Minimum an Zeit möglich darauf achten, daß die Struktur des Gehirns Schäden durchgeführt werden.
- Scheiben des Gehirns in Sagittalschnitten von 400 um mit einer Vibratom.
- Machen Sie einen sagittalen Schnitt mit einer Rasierklinge in einer Hemisphäre, versuchen, so wenig wie möglich des Kleinhirns geschnitten, das wird eine ebene Fläche zum Schneiden bieten. Der Kortex ist nur zur Unterstützung eingesetzt, um das Schneiden leichter, aber da die Zeit ein wichtiges Thema ist es bequemer, schneiden Sie die rostralen Hälfte des Kortex mit einer Rasierklinge.
- Verwenden Sie Cyanacrylat (Sekundenkleber), um die Position des Gehirns auf das Metall Vibratom befestigen. Es ist wichtig, die Platte auf Eis, bevor Sie den Kleber entspannen und es gut verteilt mit der Spitze des Rohres zu einer dünnen Klebeschicht zu bilden. Wenn es einen Überschuss von Sekundenkleber, wird es von der Platte zu lösen, wenn es in Kontakt mit dem ACSF und die Probe verloren geht.
- Sobald das Gehirn ist es, die Vibratom befestigt, fügen Sie genug ACSF Medien an das Gehirn abdecken und Eis unter der Platte zu halten es kalt.
- Cut 400 um Scheiben schneiden und übertragen Sie sie mit einem Kunststoff-Pasteurpipette (Schnitt die Spitze, um es zu erweitern und Vermeidung von Schäden an den Scheiben) zu einer 6-well Zellkulturplatte mit ACSF auf Eis.
- Separate das Kleinhirn aus dem Rest des Gehirns mit Hilfe von zwei Insulinspritzen (Spritzen mit kleinem Durchmesser 28-Gauge-Nadeln) unter dem Binokular. Einige Scheiben haben Sekundenkleber an den Rändern befestigt: Das ist der Moment, um zu versuchen, es zu entfernen, da sie die Lebensfähigkeit der Scheibe auswirken kann. Es ist wichtig, um es vorsichtig tun, ohne die Struktur des Kleinhirns.
- Übertragen Sie die zerebelläre Scheiben auf 6-well-Platten mit 30mm Zellkulturplatten-Einsätze mit 0,4 pm Poren. 1 ml der Kultur Medien pro Vertiefung, die durch Inkubation für mindestens 2 Stunden vorkonditioniert bei 37 ° C und 5% CO 2 (in der Zellkultur-Inkubator). Legen Sie die Einsätze auf der Oberseite der Medien machen, dass es keine Luftblasen unter und dann die zerebelläre Scheiben (1-3 pro Einsatz) auf der Oberseite der Einsätze machen, dass sie voll ausgefahren sind und dass keine Flüssigkeit zu überdecken. Saugen Sie über Medien, falls erforderlich. Bei 37 ° C und 5% CO 2 Änderung der Kulturmedien alle 2 oder 3 Tage. Am besten ist es nur ein Teil des Mediums (zB ½ Volumen) auf einmal zu ersetzen, da verwendete Medium enthält slice-derived trophischen Faktoren, die wichtig für das Überleben der Zelle.
2. Fas Behandlung und Färbung von zerebelläre Scheiben:
- Für die apoptotischen Herausforderung Experiment haben wir zunächst Kultur die Scheiben für 5 Tage verändernden Medienlandschaft am Tag in vitro 3 (DIV3). Auf DIV5 Kulturen werden mit 0,5 g / mL der Fas-Agonisten-Antikörper Jo2, indem Sie es direkt an die Medien, um einen sauberen Hintergrund des Zelltods, da die Veränderungen der Medien behandelt induzieren können einige Sterblichkeit in den Kulturen. Die Hälfte der Brunnen sind unbehandelt als Kontrolle.
- Nach 24 Stunden entfernen Sie die Medien unter der Einsätze durch Absaugen. Zur Fixierung der Scheiben, 1 mL eiskaltem 4% PFA unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Nach 10 Minuten entfernen Sie die PFA und waschen kurz mit kaltem PBS.
- Nächstes entfernen Sie die PBS und 1 ml unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes von 20% eiskaltem Methanol in PBS und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Dann wird noch einmal mit PBS und 1 ml unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes von 0,5% Triton-X-100 in PBS zur Permeabilisierung. Inkubieren für ein Minimum von 12 Stunden bei 4 ° C.
- Nach Permeabilisierung mit 20% BSA in PBS-Block für ein Minimum von4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. In diesem Stadium der Scheiben können in Blocking-Lösung für mindestens 3 Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden
- Um Flecken auf den Scheiben schneiden Sie vorsichtig das Stück der Membran auf die Kleinhirn-Scheibe befestigt einfügen und sie auf 24-Well-Platten mit PBS.
- Die Immunfärbung erfolgt sequentiell, getan zuerst mit TUNEL-Reagenz für 1 Stunde und dann mit Calbidin Antikörper über Nacht.
- Saugen Sie das PBS und fügen 250 ul off TUNEL-Reagenz in jedes Well sicherstellen, dass es auf der gesamten Oberfläche der Scheibe. Bei 37 ° C für eine Stunde im Dunkeln.
- Nach einer Stunde entfernen Sie die TUNEL-Mix und waschen mit PBS dreimal für 10 Minuten.
- Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die PBS und fügen 250 ul einer 1 / 1000 Verdünnung des Calbindin Antikörper in PBS und Inkubation über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln.
- Entfernen Sie den primären Antikörper-Lösung und Waschen mit PBS dreimal für 10 Minuten.
- Add 250 ul des sekundären Antikörper verdünnt 1 / 500 in PBS und Inkubation für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die TUNEL-Kit verwendeten wir mit TMR rot markiert, damit unsere sekundären Antikörper für Calbindin konjugiert ist Alexa-488.
- Dreimal 10 Minuten lang mit PBS und montieren Sie die Scheiben auf einem Glasobjektträger mit einem Eindeckmittel dass DAPI enthält.
- Bild die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop mit der 488 nm und 561 nm Wellenlänge Anregung für Calbindin und TUNEL jeweils.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Die größte Herausforderung dieses Protokolls ist in der Lage sein, gesunde Kleinhirn Scheibe Kulturen zu generieren, zumal unsere letzte Anzeige wird Zelltod werden. Eine gesunde Kultur erscheint als eine, wo die Zellkörper Schicht ist transparent und erlaubt Ihnen, die blättrige Struktur des Kleinhirns unter dem Mikroskop (Abbildung 1) zu sehen. Nach wenigen Tagen in Kultur die Scheiben beginnen zu dünn und nicht-neuronalen Zellen zu beobachten Migration weg von den Rändern der Scheibe sein. Die dunkle runde Zellen (wahrscheinlich Makrophagen), dass die Scheiben bedecken nach wenigen Tagen in Kultur, wird schließlich an Zahl abnehmen nach 10-14 Tagen in vitro (Abbildung 2) 5. Der ultimative Beweis für die Lebensfähigkeit der Scheiben ist für unterschiedliche zelluläre Marker, wie Calbindin für die Purkinjezellen Fleck. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative konfokalen Mikroskop Bild der Purkinje-Zellschicht mit mehreren TUNEL positive Kerne.
Es ist wichtig zu bedenken, dass, selbst wenn einige Scheiben erhielt einen apoptotischen Stimulus, sie seien nur für 24 Stunden ausgesetzt. Dies ermöglichte es genügend Zeit, um DNA-Fragmentierung in den sterbenden Zellen mit der TUNEL-Färbung zu beobachten, sondern eine definierte Purkinje-Zellschicht noch vorhanden war.
Abbildung 1. Gesunde Kleinhirn Scheibe bei DIV2. Dieses Bild zeigt die transluzente Zellkörper Schicht und die blättrige Struktur des Kleinhirns in einem gesunden Stück.
Abbildung 2. Gesunde Kleinhirn Scheibe an DIV 7. In diesem Bild können wir immer noch beobachten, die blättrige Struktur des Kleinhirns und das Auftreten von dunklen Zellkörper.
Abbildung 3. Repräsentatives Bild der Fas-behandelten Kleinhirn in Scheiben schneiden. Das konfokale Abbildung zeigt die Purkinje-Zellen mit Calbindin (grün) und die apoptotischen Zellen positiv für TUNEL-Färbung (rot) gefärbt. Purkinje-Zellen nicht in einer einzigen Zeile erscheinen, sind aber geclusterten Bildung einer folium-ähnliche Struktur.
Discussion
Diese Methode beschreibt eine der vielen möglichen Anwendungen von neuronalen organotypischen Kulturen und es hat uns erlaubt, die Wirkung von apoptotischen Stimuli in Wildtyp und Mutante zerebelläre Scheiben zu studieren.
Der wichtigste Teil dieses Experiments ist in der Lage sein, konsequent zu erzeugen gesunde Kleinhirn Scheibe Kulturen. Die wichtigsten Faktoren sind Dissektion und Schneiden-Technik und die Fähigkeit, das Protokoll in der kürzesten Zeit möglich durchzuführen, aber gleichzeitig darauf achten, daß die Scheiben beschädigt. Ein weiterer entscheidender Faktor ist die Herstellung und Zusammensetzung der Nährmedien, werden diese Kulturen sehr empfindlich, so mussten wir einige Rezepte und Marken der Medien zu testen. Selbst unterschiedliche Chargen von Serum oder andere Komponenten der Medien konnte die Lebensfähigkeit der Scheiben. Wir haben die besten Ergebnisse mit dem Pferd Serum von Invitrogen Lot # 480116.
Sobald die zerebelläre Scheiben erzeugt werden kann Studie des Kleinhirns Entwicklung, Elektrophysiologie, das Überleben der Zelle allein oder in Reaktion auf apoptotische Stimuli, Exzitotoxizität oder Sauerstoffmangel. Vergleichende Studien mit Wildtyp und Mutante zerebelläre Scheiben sind sehr aufschlussreich in vielen Aspekten des Kleinhirns Funktion und Entwicklung.
Disclosures
Alle tierischen Arbeit durchgeführt wurde in Übereinstimmung mit den Sicherheitsrichtlinien des IACUC gegründet getan. Die Salk-Institut ist eine AAALAC akkreditierten Labor.
Acknowledgments
Diese Studie wurde zum Teil durch die IPSEN-Stiftung finanziert. IMV ist ein American Cancer Society Professor für Molekularbiologie, und hält die Irwin und Joan Jacobs Lehrstuhl in Beispielhafte Life Sciences. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem NIH, Leducq Foundation, Mériaux Stiftung Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, und die HN und Frances C. Berger Stiftung unterstützt. PAS wird von McKnight Endowment Fund for Neuroscience und dem National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022) finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Mark Schmitt bedanken. Graphik wurde von Jamie T. Simon entwickelt. Sponsorship wurde freundlicherweise von Invitrogen zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
