Summary
निर्माण और एक कोशिकी चूषण नवजात कृंतक रीढ़ की हड्डी डोरियों के electrophysiological रिकॉर्डिंग को मापने के लिए इस्तेमाल किया इलेक्ट्रोड के उपयोग का एक प्रदर्शन
Abstract
तंत्रिका circuitries और हरकत के विकास नवजात कृंतक रीढ़ की हड्डी में केंद्रीय पैटर्न जनरेटर व्यवहार (CPG) का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. हम dissected कृंतक रीढ़ की हड्डी डोरियों में एक चूषण इलेक्ट्रोड है कि CPG गतिविधि की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, या कल्पित हरकत बनाना विधि प्रदर्शित करता है. कृंतक स्पाइनल तार कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में रखा जाता है और उदर जड़ों चूषण इलेक्ट्रोड में तैयार कर रहे हैं. इलेक्ट्रोड एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूषण इलेक्ट्रोड को संशोधित से निर्माण किया है. भारी चांदी के तार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इलेक्ट्रोड के द्वारा दिए गए मानक तार के बजाय प्रयोग किया जाता है. वाणिज्यिक इलेक्ट्रोड पर कांच टिप बढ़ स्थायित्व के लिए एक प्लास्टिक की टिप के साथ बदल दिया है. हम हाथ खींचा इलेक्ट्रोड और टयूबिंग के विशिष्ट आकार से बनाया इलेक्ट्रोड की तैयारी कर रहे हैं, स्थिरता और reproducibility की अनुमति. डेटा एक एम्पलीफायर और neurogram अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एकत्र की है. रिकॉर्डिंग एक हवा की मेज पर एक फैराडे पिंजरे के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं यांत्रिक और बिजली के हस्तक्षेप को रोकने के लिए, क्रमशः.
Protocol
पृथक रीढ़ की हड्डी डोरियों के electrophysiological रिकॉर्डिंग आनुवंशिक और विकासात्मक परिवर्तन तंत्रिका circuitry के एक करने के लिए प्रकट कर सकते हैं. हम पहले से एक विधि का प्रदर्शन करने के लिए नवजात माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों 2 काटना. यहाँ हम एक चूषण पृथक रीढ़ की हड्डी में तीन डोरियों में कल्पित हरकत रिकॉर्डिंग में उपयोगी इलेक्ट्रोड तैयार विधि प्रस्तुत करते हैं.
एक प्लास्टिक टयूबिंग इलेक्ट्रोड की नोक शराब कम तापमान 3-5 दीपक का उपयोग कर हाथ से एक बहुत अच्छी टिप के लिए तैयार किया जा सकता है. एक निंदनीय रूप में टयूबिंग नरम प्लास्टिक टयूबिंग (PE90, क्ले एडम्स Intramedic टीएम) लौ पर आयोजित किया जाता है. के रूप में टयूबिंग पिघला करने के लिए शुरू होता है और अधिक पारदर्शी हो जाता है यह गर्मी स्रोत और समाप्त होता है धीरे अलग निकाला जाता है से हटा दिया है. लौ से ट्यूब को हटाने के समय महत्वपूर्ण है के लिए बीमा के लिए प्लास्टिक पतन या नहीं विभाजन जबकि तैयार किया जा रहा है. टयूबिंग की पतली भाग एक धार के साथ वांछित आंतरिक व्यास के अनुसार कट जाता है, के रूप में नमूना या कॉर्ड की कमानी स्तर की उम्र से तय है. टयूबिंग पर एक O-अंगूठी रखने की आसानी के लिए, एक 45 ° कटौती एक धार के साथ टयूबिंग की मोटी अंत में किया जाता है. एक सामी और O-अंगूठी मोटी छोर पर स्थापित कर रहे हैं इलेक्ट्रोड का बैरल इलेक्ट्रोड टिप देते हैं.
विशेष रूप से आकार इलेक्ट्रोड के लिए अनुमति देने के लिए और की कठिनाइयों से बचने के हाथ खींच सुझावों इलेक्ट्रोड, इलेक्ट्रोड छोटे से एक मोटा टयूबिंग (PE90) में सम्मिलित टयूबिंग का उपयोग कर निर्मित किया जा सकता है. टयूबिंग की लंबाई रिकॉर्डिंग सेटअप की आवश्यकताओं के लिए विशिष्ट हैं और चर रहे हैं. हम हमारे 1-3,5 प्रयोगों में इस्तेमाल किया माप उपस्थित थे. PTFE ठीक है (ज़ीउस, लघु पार्ट्स) टयूबिंग और PE90 टयूबिंग की एक 10cm की लंबाई के एक 1cm लंबाई एक धार के साथ काट रहे हैं. छोटे टयूबिंग की छोर को यकीन है कि वे या कुचल बंद नहीं कर रहे हैं करने के लिए जांच की जानी चाहिए. वे एक कीट पिन (ललित विज्ञान उपकरण) का उपयोग कर खोला जा सकता है है. चिपकने वाला (जेबी वेल्ड) की एक बूंद PTFE टयूबिंग के midpoint पर रखा गया है. PTFE टयूबिंग और चिपकने वाला PE90 PE90 टयूबिंग पर मुंह चूषण का उपयोग टयूबिंग में तैयार कर रहे हैं. एक 45 ° कटौती टयूबिंग की मोटी अंत में किया जाता है और एक सामी और O-अंगूठी संलग्न हैं, के रूप में पिछले.
सामी और संबंधक BNC एक वाणिज्यिक चूषण इलेक्ट्रोड से unscrewed हैं. संबंधक BNC xylene में एक घंटे के लिए भिगो मोम सील हटाने. संबंधक तो पानी में rinsed है और सूखे.
एक कम angled पक्ष बंदरगाह प्रति बैरल के किनारे पर बनाया जाना चाहिए. एक धातु की छड़ एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर गर्म है और एक कम कोण पर प्रति बैरल की तरफ मौजूदा छेद में दबाया. 0.010 इंच चांदी के तार (AM सिस्टम) की एक 15cm लंबाई में कटौती की है और पंद्रह मिनट के लिए ब्लीच में भिगो. यह एक चांदी क्लोराइड कोटिंग है कि संकेत 6 चालन में एड्स बनाने के लिए किया जाता है. तार पानी से rinsed है, सूखे, और फिर संबंधक BNC पर soldered. संबंधक BNC और चांदी के तार BNC संबंधक प्रति बैरल की ओर रहने के लिए पर्याप्त कमरे के साथ चूषण इलेक्ट्रोड बैरल में डाला जाता है. सक्शन टयूबिंग 2-3cm पक्ष बंदरगाह में डाला जाता है. सिलिकॉन सीलेंट बैरल लगभग 2-3cm में अंतःक्षिप्त है. संबंधक BNC सीलेंट आगे धक्का इलेक्ट्रोड की नली में पिरोया है.
इलेक्ट्रोड की नोक अब इलेक्ट्रोड के सामने अंत में पिरोया है. सिकोड़ें ट्यूबिंग भी पक्ष पोर्ट से चूषण लाइन को सुदृढ़ करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
इलेक्ट्रोड micromanipulators कि चुंबकीय खड़ा करने के लिए संलग्न हैं, और रिकॉर्डिंग पकवान के पास रखा पर बढ़ रहे हैं. BNC समाक्षीय केबल एक headstage है कि एक एम्पलीफायर के लिए वायर्ड है जुड़े होते हैं. प्रवर्धक (Polyview) एडाप्टर है कि डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (Polyview) के साथ एक पीसी कंप्यूटर में डिजिटल कार्ड के लिए एक एनालॉग (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) से जुड़ा है जुड़ा हुआ है.
जब electrophysiological डेटा रिकॉर्डिंग, यह सभी बाहरी हस्तक्षेप को खत्म करने के लिए आवश्यक है. रिकॉर्डिंग पकवान, एम्पलीफायर, और सिर चरण एक हवा की मेज पर एक फैराडे पिंजरे के भीतर रखा जाता है बिजली और यांत्रिक हस्तक्षेप रोकने के लिए, क्रमशः.
प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूषण इलेक्ट्रोड एक भारी गेज चांदी के तार और एक प्लास्टिक की टिप है कि हाथ है एक शराब दीपक पर तैयार है, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विशिष्ट आकार के प्लास्टिक टयूबिंग के साथ निर्माण जोड़कर संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, आयल सीलेंट अधिक टिकाऊ सिलिकॉन गहनी करना सीलेंट के साथ बदल दिया है.
चित्रा 2. हवा तालिका के संबंध में चूषण इलेक्ट्रोड का एक योजनाबद्ध (यांत्रिक अलगाव के लिए), फैराडे पिंजरे (बिजली isolati) पर, एम्पलीफायर और कंप्यूटर. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वहाँ एक रिकॉर्डिंग पकवान और एक दूसरे की जमीन है कि हवा मेज और फैराडे पिंजरे करने के लिए संदर्भित है को संदर्भित जमीन है.
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Discussion
तंत्रिका तंत्र के विकास पृथक कृंतक स्पाइनल तार का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. न्यूरोट्रांसमीटर की उपस्थिति में, कल्पित हरकत नमूनों बिजली 1,3 गतिविधि के रूप में रीढ़ की हड्डी से उत्पन्न किया जा सकता है . इन लयबद्ध फटने 0,2 करने के लिए 0,5 हर्ट्ज में उत्पादित कर रहे हैं और कर रहे हैं बाएँ - दाएँ और flexor - extensor alternations में नमूनों. विभिन्न विकासात्मक चरणों में, मजबूती और इस गतिविधि के पैटर्न 1 बदलता रहता है. जेनेटिक म्यूटेशन भी इस गतिविधि के 3,5,7 patterning को परेशान कर सकते हैं . इस गतिविधि के ट्रांसजेनिक और विकासात्मक अध्ययन केंद्रीय पैटर्न पैदा circuitry के संगठन में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और तंत्रिका विकास के अध्ययन को सूचित, आम तौर पर.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
शमूएल एल Pfaff जीन एक्सप्रेशन प्रयोगशालाओं में जैविक अध्ययन के लिए सॉल्क संस्थान में एक प्रोफेसर और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट में एक अन्वेषक है. यह काम क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. जो Belcovson, केंट Schnoeker और सॉल्क संस्थान में मल्टीमीडिया संसाधन में माइक सुलिवान फोटोग्राफी और संपादन के साथ सहायता प्रदान की है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
