从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

摘要

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。

摘要

我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控钾通道的表达及其功能作用。由于目前缺乏针对这些通道的特异性药理学工具，我们采用了遗传学方法来调控通道的表达。我们采用脑片器官型培养方法（16），以维持细胞形态以及皮层的分层结构。通常在出生后第8至10天急性分离新皮层脑片，并将脑片在体外培养3至7天。这种方法使我们能够在与急性脑片实验相似的发育阶段研究神经元，同时最大限度地减少脑片中过度兴奋性连接的形成。我们通过红外照明（IR）结合微分干涉差显微镜（DIC）技术，在电流钳或电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录，对II/III层或V层中经视觉识别的锥体神经元进行电生理记录。为调控钾通道的表达以研究其功能，我们采用基因枪（生物弹道）法转染野生型或突变型钾通道DNA。通过共转染绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA，可在转染后利用落射荧光显微镜轻松识别转染的细胞。我们将同一脑片同一皮层内转染细胞的记录结果与邻近未转染神经元的记录结果进行比较。

方案

1. 切片日前的准备工作

我们发现，在切片当天之前对手术器械进行高压灭菌并配制溶液更为高效。

1. 对器械进行高压灭菌。（手术和切片操作在半无菌条件下进行）。将以下物品分别用高压灭菌纸包裹后，单独进行高压灭菌：
   • 手术包：刮勺、#22 手术刀柄、剪刀、镊子
   • 切片包：三个旋钮（刀片固定旋钮和两个浴槽固定旋钮）和刀片护罩（用于固定切片机上的剃须刀片：Campden Vibroslice，货号 #MA572），分别单独包裹（因其需放入冷冻保存）；定制金属切片槽（标本槽，用于切片机；厂家提供的聚甲基丙烯酸甲酯材质槽无法耐受反复高压灭菌）；止血钳、剪刀、镊子
   • 玻璃器皿包：两个 50 mL 烧杯和一个 25 mL 烧杯
2. 分装马血清（Hyclone 供体马血清，货号 #SH 30074：Thermo Scientific）。将约 11 mL 马血清分装至 15 mL 圆锥形离心管中。（实际需要 10 mL 血清；由于血清解冻时会产生气泡，因此需准备 11 mL 以便准确吸取所需的 10 mL）。将分装后的血清储存于 -20°C 冰箱中。
3. 分装培养基。培养基瓶开启后仅可稳定....

讨论

我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控性钾通道的表达及其功能作用（4, 9-11）。由于目前缺乏针对这些通道的特异性药理学工具，我们采用遗传学方法来调控通道的表达（1,14,15,17-19）。我们采用一种改良自Stoppini et al.（16）的器官型脑片培养方法（2,3;5-8;12,13,15-22），以维持细胞形态以及皮层的分层结构。我们在出生后第6至17天获取急性新皮层脑片，并在体外培养2至7天。这种方法使我们能够研究与急性脑片实验中年龄相近的神经元，同时最大限度地减少脑片中过度兴奋性连接的形成。我们通过红外照明（IR）结合微分干涉差显微镜（DIC）技术，在电流钳或电压钳模式下对II/III层或V层中视觉识别的锥体神经元进行全细胞膜片钳记录。通过基因枪（Biolistic）转染野生型或突变型钾通道DNA，调控通道表达以研究其功能（1,14,15,17）。通过与GFP的cDNA共转染，可在落射荧光显微镜下轻松识别转染的细胞。我们将同一脑片同一皮层层中相邻的未转染神经元作为对照，与转染细胞的记录结果进行比较（1,17）。

本文所述的所有操作步骤均.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术 / 转染 / 培养 <李>脑切片仪：Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments，美国佛罗里达州萨拉索塔<李>基因枪系统：Bio-Rad Helios #165-2431（Bio-Rad Laboratories，1000 Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547） <李>包含：基因枪、带调节器的氦气软管组件、管路制备站（#165-2418）、注射器套件、特氟龙涂层管、管路切割器、优化套件（#165-2424）、管路切割器 Bio-Rad 氦气调节器（#165-2413） <李>Bio-Rad Helios 一次性耗材 <李>1.6 μm 金微载体：#165-2264<李>Tefzel 管道：#165-2441 <李>培养箱：Forma Scientific 型号 #3110（Thermo-Scientific：(866) 984-3766） 媒体： <李>马血清：Hyclone 供体马血清 #SH 30074。（HyClone，美国犹他州洛根市西1800南街925号，84321） HMEM（不含谷氨酰胺的最低必需培养基，含HBSS和HEPES：Lonza BioWhittaker 目录号#12-137F）：GIBCO/INVITROGEN，(800) 955-6288，选项1。 <李>HBSS（GIBCO Hank's 平衡盐溶液，#24020-117）：GIBCO/INVITROGEN，(800) 955-6288，选项 1。<李>MEM（GIBCO最小必需培养基，#12360-038），GIBCO/INVITROGEN，(800) 955-6288，选项1。<李>250 mL Millipore 0.2 μm 滤膜：#SC6PU02RE<李>塑料移液管：Fisher #13-711-20。<李>50 mL Millipore Steriflip 0.22 μm 滤膜 (#SCGP00525) 第6-8项物品购自：Fisher Scientific，1241 Ambassador Blvd，P.O. Box 14989，St. Louis，MO 63132。 记录： <李>移液管玻璃：Harvard GC150TF-10：Harvard Apparatus，美国马萨诸塞州霍利斯顿十月山道84号，01746<李>Sutter P-87 水平电极拉制仪：Sutter Instrument 公司，One Digital Drive，诺瓦托，加利福尼亚州 94949<李>Axon Instruments Multiclamp 700B 放大器：Molecular Devices, Inc.，美国加利福尼亚州森尼韦尔市奥尔良斯大道1311号，邮编 94089-1136<李>PClamp 10 数据采集软件：Molecular Devices, Inc.，1311 Orleans Drive，Sunnyvale，CA 94089-1136 <李>电极位置由 Sutter R 控制–-200 操作臂与 PC-200 控制器： <强>Sutter Instrument Company美国加利福尼亚州诺瓦托数字大道1号，邮编94949 <李>显微镜：Olympus BX-50WI 直立显微镜，配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统<李>对红外敏感的相机 OLY-150（Olympus）或 DAGE-MTI（DAGE-MTI，01 North R–ske大道，密歇根城，印第安纳州 46360