यह एक तैयार करने और पिरामिड न्यूरॉन्स से बिजली रिकॉर्डिंग बनाने के प्रयोजन के लिए एक neocortical टुकड़ा तैयारी बनाए रखने organotypic संस्कृति में प्रोटोकॉल है.
हम चूहे neocortex से पिरामिड न्यूरॉन्स में वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों की अभिव्यक्ति और कार्यात्मक भूमिका का अध्ययन किया गया. इन चैनलों के लिए विशिष्ट औषधीय एजेंटों की कमी के कारण, हम चैनल अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ करने के लिए एक आनुवंशिक दृष्टिकोण ले लिया है. हम एक organotypic संस्कृति तैयारी (16) का उपयोग क्रम में सेल आकारिकी और प्रांतस्था के लामिना पैटर्न को बनाए रखने के लिए. हम आम तौर पर प्रसव के बाद दिन 8-10 पर तीव्र neocortical स्लाइस को अलग और संस्कृति में स्लाइस को बनाए रखने के 3-7 दिनों के लिए. यह हमें तीव्र स्लाइस के साथ हमारे काम में उन लोगों के लिए एक समान उम्र में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है और टुकड़ा में विपुल उत्तेजक कनेक्शन के विकास कम से कम. हम परतों द्वितीय / तृतीय या वी में नेत्रहीन पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान वर्तमान या वोल्टेज क्लैंप में पूरे सेल पैच दबाना के साथ अवरक्त (आईआर) रोशनी और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी) का उपयोग से रिकॉर्ड है. हम जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पोटेशियम चैनल डीएनए (जीन बंदूक) के biolistic अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए उनके कार्य का अध्ययन करने के लिए चैनलों की अभिव्यक्ति में हेरफेर. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को आसानी से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए सीडीएनए के साथ सह – अभिकर्मक के बाद epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा की पहचान कर रहे हैं. हम एक ही टुकड़ा से ही परत में आसन्न, untransfected न्यूरॉन्स ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग की तुलना.
हम चूहा neocortex (4, 9-11) से पिरामिड न्यूरॉन्स में वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों के अभिव्यक्ति और कार्यात्मक भूमिकाओं अध्ययन किया गया. क्योंकि इन चैनलों लिए विशिष्ट औषधीय एजेंटों की कमी के, हम चैनल अभिव्यक्ति (1,14,15…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों बकाया तकनीकी सहायता लिए Mayumi Sakuraba और रेबेका Foehring धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, हम डीआरएस धन्यवाद ठहरना चाहते. रॉड्रिगो Andrade हमें अभिकर्मक लिए सीडीएनए constructs साथ प्रदान लिए organotypic टुकड़ा संस्कृति और biolistic अभिकर्मक प्रोटोकॉल और डा. Nerbonne कार्यान्वित में सहायता लिए. NS044163 NINDS (आरसीएफ के लिए) से: इस काम NIH अनुदान था समर्थित द्वारा.
Surgery / transfection / culture:
Media:
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording: