Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

Summary

Ce protocole définit un moyen d'étiqueter et de tracer le destin de petits groupes de cellules du poisson zèbre en utilisant UV-uncaging de fluorescéine en cage, suivi par l'ensemble de montage immunomarquage pour amplifier le signal de la fluorescéine Uncaged.

Abstract

Un problème central dans la biologie du développement est de déduire l'origine de la myriade de types de cellules présentes dans les vertébrés à mesure qu'ils surviennent à partir de précurseurs indifférenciés. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodes d'étiquetage lignée, tels que l'étiquetage DiI ¹ et l'injection sous pression d'enzymes traçable ² à déterminer le destin des cellules à des stades ultérieurs de développement dans des systèmes modèles. Les cartes sort d'abord dans le poisson zèbre (Danio rerio) ont été assemblés par injection iontophorétique de colorants fluorescents, tels que la rhodamine dextrane, dans des cellules individuelles dans des régions discrètes de l'embryon et le traçage le sort de la cellule marquée au cours du temps ^3-5. Bien qu'ils soient efficaces, ces méthodes sont techniquement exigeantes et nécessitent un équipement spécialisé ne trouve pas couramment dans les laboratoires de poisson zèbre. Récemment, photoconvertable protéines fluorescentes, comme Eos et Kaede, qui irréversiblement passer du vert au rouge lorsque la fluorescence est exposé aux ultraviolets, voient une utilisation accrue chez le poisson zèbre ^6-8. La clarté optique de l'embryon de poisson zèbre et la facilité relative de la transgénèse ont fait de ces outils particulièrement attrayant pour l'étiquetage lignée et d'observer la migration des cellules in vivo ^7. Malgré leur utilité, ces protéines ont quelques inconvénients par rapport aux colorants médiée par des méthodes d'étiquetage lignée. La plupart des cruciale est la difficulté que nous avons trouvés dans l'obtention de 3-D haute résolution pendant photoconversion de ces protéines. Dans cette perspective, peut-être la meilleure combinaison de résolution et de facilité d'utilisation pour l'étiquetage de la lignée dans le poisson-zèbre se sert de cage fluorescéine dextrane, un colorant fluorescent qui est lié à un groupe de trempe qui masque ses ⁹ fluorescence. La teinture peut alors être "Uncaged" (publié par le groupe de la trempe) dans une cellule spécifique en utilisant la lumière UV d'une lampe laser ou le mercure, permettant la visualisation de sa fluorescence ou immunodétection. Contrairement aux méthodes d'iontophorèse, la fluorescéine cage peut être injecté à des appareils d'injection standard et Uncaged avec un microscope à épifluorescence équipé d'un trou d'épingle ^10. En outre, les anticorps contre la fluorescéine ne détecter que le formulaire en liberté, et l'épitope de fixation ainsi survit ^11. Enfin, la fluorescéine en cage peuvent être activées à très haute résolution en 3-D, en particulier si la microscopie à deux photons est utilisée ^12,13. Ce protocole décrit une méthode d'étiquetage par la lignée de fluorescéine en cage et uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluorescéine est détectée simultanément avec les autres épitopes telles que la GFP en marquant avec des anticorps.

Protocol

1. Synthèse de la cage fluorescéine dextrane

1. Mesurer 3,5 à 4 mg de aminodextrane et ajouter dans le tube Invitrogen fournis teintées contenant 1 mg de CMNB-cage SE fluorescéine. Dans nos mains ce ratio donne une moyenne de chargement de ~ 2,5 molécules de colorant par le dextran.
2. Ajouter 500 ul de 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ tampons (borate de sodium) dans le tube.
3. Cap et le vortex pendant 30 secondes pour dissoudre le aminodextrane et la fluorescéine en cage.
4. Laissez réagir toute la nuit sur un mélangeur vortex.
5. Dévissez la fermeture de fond sur une colonne spin Zeba et desserrer le bouchon. Marquer un point sur la colonne avec un stylo-feutre. Colonne de la Place dans un tube de 15 ml conique.
6. Centrifuger à 1000 xg pendant 2 minutes avec le point face au centre du rotor. Utiliser la colonne immédiatement après compactage.
7. Placer la colonne compactée dans une nouvelle de 15 ml tube conique.
8. Mélange réactionnel piscine et le transfert vers le centre du lit de résine colonnes compactées. Remettre le bouchon.
9. Centrifuger à 1000 xg pendant 2 minutes avec le point face au centre du rotor. Après le spin, l'éluant et le haut de la colonne sera à peu près la même nuance de couleur jaune.
10. Transfert de l'éluant jaune (~ 350 pi) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
11. Lyophiliser à sec dans une speedvac. Couvrir le speedvac papier d'aluminium.
12. Re-suspendre le résultant ~ 2-3 mg de mousse jaune pâle dans l'eau à une concentration finale de 1% p / v.
13. Conserver cette solution à -20 ° C dans du papier recouvert de tubes. C'est une bonne idée de partie aliquote de la solution de dextrane pour empêcher congélation-décongélation répétés.

2. L'injection de fluorescéine Caged Dextran dans des embryons de poisson zèbre

1. Diluer à 1% p / v stock de cage 01h05 fluorescéine dextran ou 01h10 dans KCl 0,2 M.
2. Injecter 0,5 - 1.0nL de solution de fluorescéine en cage dans un jaune d'embryons au stade de cellule à l'aide d'un injecteur à pression. Une fois injecté, embrayages d'embryons doivent être maintenus dans l'obscurité à 28,5 ° C pour réduire la non-spécifiques uncaging.
3. Supprimez manuellement chorions à partir d'embryons.
4. Anesthetize embryons dans 4% tricaïne.
5. Les embryons seront montés dans agarose à 0,8% dans la boîte de Petri 35mmx10mm, puis recouverte d'eau d'œuf.
6. Equilibrer fondue agarose dans 50 blocs ° C chaleur pendant au moins 15 minutes.
7. En utilisant une pipette en verre, d'élaborer un embryon dans un minimum d'eau et de le libérer dans l'agarose. Remarque: Il est important de refroidir le tube d'agarose dans votre main pendant environ 30 secondes avant de mettre l'embryon dans le tube pour éviter tuer l'embryon.
8. Pipeter l'embryon dans le tube, avec environ 50 pl d'agarose et éjecter le contenu sur le centre de la boîte de Pétri.
9. Vite orienter l'embryon à l'aide d'un fil en plastique avec les cellules à Uncaged vers le haut. Remarque: Le agarose refroidir rapidement afin d'être précipitée orientant l'embryon. Les embryons peuvent être endommagés si manipulé après la agarose devient rigide.
10. Laisser l'agarose solidifier complètement (cela prend quelques minutes) et remplir les deux tiers vaisselle avec de l'eau d'œuf contenant 4% tricaïne et PTU 0,003%.

3. Laser Uncaging de fluorescéine dextrane

1. Le microscope utilisé pour uncaging doit avoir un objectif 40X d'eau par immersion.
2. Nous utilisons un laser photonique Instruments avec la cellule de teinture de 365 nm et 70% / 30% miroir fractionné dichroïque.
3. Avant uncaging, le laser doit être faite parfocale avec l'objectif et atténué à la puissance appropriée.
4. Pour concentrer le laser, placer une lame de verre en miroir sous l'objectif et de se concentrer l'objectif jusqu'à ce rayures dans la diapositive sont visibles.
5. Ajuster au laser atténuateur jusqu'à ce que le laser peut produire une rayure visible dans le miroir avec une seule impulsion.
6. Ajustez le point de vue objectif de haut en bas. Si le laser peut produire une égratignure lorsque l'objectif est hors de discussion, ajuster la focalisation du laser ¼ de tour vers le haut ou vers le bas. Répétez jusqu'à ce que le laser peut rayer le miroir seulement lorsque l'objectif est focalisé.
7. Placez montée embryon titre de l'objectif et se concentrer sur la zone à Uncaged.
8. Pour uncage, se concentrer sur une cellule d'intérêt et d'impulsion de l'10-20 fois à 2-3 Hz.
9. Après uncaging, sans l'embryon par déroulage agarose loin avec une pince et en les mettant dans de l'eau contenant des oeufs PTU 0,003%. Laissez les embryons se développent dans une boîte étanche à la lumière jusqu'à ce qu'ils soient fixes.

4. Marquage de l'anticorps et la détection des Uncaged fluorescéine dextrane

1. Fixer des embryons dans Ab fixateur (paraformaldéhyde à 4%, 0,3 _CaCl2, 8% de saccharose, phosphate 1X saline tamponnée, pH 7,3) pendant deux à quatre heures à température ambiante (RT) ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Gardez embryons dans une boîte étanche à la lumière ou la papillote tube pour toutes les mesures d'étiquetage.
2. Retirer fixateur et le remplacer par du MeOH 100%, laisser reposer 10 minutes à température ambiante, enlever MeOH et remCE avec MeOH 100% frais.
3. Conserver dans MeOH à -20 ° C pendant au moins 30 minutes. Note: Vous pouvez stocker dans MeOH pour un maximum de deux semaines avant épitopes commencent à se dégrader.
4. Réhydrater embryons avec lavages de 5 minutes à température ambiante de phosphate MeOH/1X 75% saline tamponnée avec 0,1% de Tween 20 (1X PBSTw), puis 50% 1XPBTw MeOH/50%, puis 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Laver trois fois pendant 5 minutes dans 1XPBSTw.
6. Si les embryons sont> 24 heures, permiabilize embryons avec 10 ug / ml de protéinase K dans 1XPBSTw. Le temps est dépendant Permiabilization sur scène. Cinq minutes de la protéinase K est suffisante si les embryons sont entre 24 et 48 heures après la fécondation (HPF). Plus de temps peut être nécessaire si des larves plus âgées. Re-fixer dans Ab fixateur pendant 20 minutes à température ambiante
7. Lavez cinq fois pendant 5 minutes dans 1XPBSTw à température ambiante.
8. Incuber dans une solution de bloc (1XPBS, Triton X100 à 0,1%, 10% de sérum de moutons, 10% d'albumine de sérum bovin, 1% de diméthylsulfoxyde) pendant 1-2 heures à température ambiante.
9. Diluer anticorps primaire (anti-fluorescéine ainsi que des anticorps contre un type de cellule des marqueurs spécifiques) dans une solution de blocage.
10. Incuber embryons O / N à 4 ° C dans une solution contenant des anticorps primaires.
11. Laver quatre fois pendant 20 minutes dans 1XPhosphate saline tamponnée avec du Triton X100 à 0,1% (PBSTx) à température ambiante.
12. Diluer fluorescence des anticorps secondaires marqués (généralement 1:300) dans une solution de blocage.
13. Incuber O / N à 4 ° C dans une solution contenant des anticorps secondaires.
14. Laver quatre fois pendant 20 minutes dans 1XPBSTx à température ambiante.
15. Embryons Clear 1XPBS 50% glycerol/50% pour au moins deux heures à température ambiante, puis retirez le glycérol / PBS et ajouter le mélange de glycérol à 100% et laisser reposer O / N à 4 ° C.

5. Les résultats représentatifs:

Après immunomarquage, il devrait y avoir une zone enrichie d'une coloration dans les cellules qui ont été Uncaged (Figure.1). Il n'est pas rare de voir un signal relativement élevé par rapport au bruit de> 48 heures zebrafish vieux, à cause de uncaging spontanée de la fluorescéine.

Figure 1. Étiquetage du poisson zèbre Lineage pinéale complexes. A 24 HPF, une partie de l'ébauche antérieure pinéale, indiqué par foxd3:. Expression de la GFP, a été Uncaged utilisant des impulsions laser UV A) Par 48hpf, un cluster du côté gauche de cellules appelées les parapineal (cercle rouge) a émergé de la Uncaged domaine (cercle blanc). B) Uncaged signal de la fluorescéine est enrichi en parapineal (cercle rouge) et la glande pinéale (cercle blanc).

Discussion

Tel que décrit, ce protocole fournit une méthode relativement rapide lignée étiquetage du poisson zèbre qui est construit sur les techniques couramment utilisées de microinjection, microscopie, et immunofluorescence. Nous avons trouvé que le laser uncaging d'être le moyen le plus efficace et rentable de uncage fluorescéine de manière localisée. Cette méthode pourrait être utilisée pour étiqueter la lignée avec les terminaux expérimentale aussi tard que 4 dpf. Cependant, comme les cellules se divisent, la concentration en cage-fluorescéine par cellule diminue éventuellement au-delà des niveaux détectables. De plus, il ya eu des rapports spontanés, non spécifiques uncaging de fluorescéine dans les larves de poisson zèbre ^11. En tant que tel, la détection de fluorescéine Uncaged est le plus efficace dans la phase larvaire au début (48-72 HPF) ou plus tôt.

Notre méthode préférée est uncaging par l'utilisation d'un laser à azote pulsé. Ils sont communément utilisés pour des expériences d'ablations des cellules et sont suffisamment précis pour uncage cellules singe ou de petits groupes de cellules ^11-12. Toutefois, uncaging peut également être accomplie en utilisant un microscope confocal, à deux photons microscopie confocale ont été utilisés pour atteindre uncaging très précis ^12. À l'autre extrémité du spectre, si la précision n'est pas requise, un laser est dispensable. Un microscope à épifluorescence équipé d'un ensemble DAPI filtre peut être utilisé pour uncage par une petite piqûre ^11.

Nous avons constaté que la détection de fluorescéine Uncaged utilisant un anticorps primaires et secondaires d'immunofluorescence qui émet une longueur d'onde rouge ou rouge lointain (par exemple, Alexa 633) convient le mieux à nos besoins. Cela nous permet de distinguer la fluorescéine Uncaged de la GFP exprimée par un transgène (figure 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3