Sept étapes pour Stellate Cellules

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour l'isolement de cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. Pour la purification de cellules étoilées, les foies de souris sont digérés In situ Et In vitro Par la pronase-collagénase traitement préalable à la centrifugation en gradient de densité. Cette technique rendements très pure cellules étoilées du foie.

Résumé

Cellules étoilées du foie sont le foie-résident des cellules de morphologie en forme d'étoile et sont situés dans l'espace de Disse entre les cellules endothéliales sinusoïdales du foie et de ^1,2 hépatocytes. Cellules étoilées sont dérivées à partir de précurseurs de moelle osseuse et de stocker jusqu'à 80% de la vitamine A totale du corps ^{1, 2.} Lors de l'activation des cellules étoilées se différencier en myofibroblastes pour produire la matrice extracellulaire, contribuant ainsi à ³ fibrose hépatique. Basé sur leur capacité à se contracter, les cellules étoilées myofibroblastique peut réguler le tonus vasculaire associée à l'hypertension portale ^4. Récemment, nous avons démontré que les cellules étoilées du foie sont des cellules présentant l'antigène puissants et peuvent activer les cellules NKT ainsi que les lymphocytes T conventionnels ^5.

Nous présentons ici une méthode pour la préparation efficace des cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. En raison de leur localisation périsinusoïdales, l'isolement de cellules étoilées du foie est un processus multi-étapes. Afin de rendre accessibles les cellules étoilées à l'isolement de l'espace de Disse, foies de souris sont perfusées in situ avec le E enzymes digestives pronase et la collagénase P. perfusion Après, le tissu hépatique est soumis à un traitement enzymatique supplémentaire avec pronase E et P dans la collagénase vitro. Par la suite, la méthode tire parti de l'énorme quantité de gouttelettes lipidiques de vitamine A-stockage dans les cellules étoilées du foie. Cette fonctionnalité permet la séparation des cellules étoilées du foie d'autres types de cellules par centrifugation sur un gradient de 8% Nycodenz. Le protocole décrit ici donne une population très pure et homogène de cellules étoilées. Pureté de la préparation peut être évaluée par coloration de la molécule marqueur protéique fibrillaire gliale acide (GFAP), avant l'analyse par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux. En outre, la microscopie optique révèle l'aspect unique de la forme d'étoile cellules étoilées du foie qui abritent de grandes quantités de gouttelettes lipidiques.

Pris ensemble, nous présentons un protocole détaillé pour l'isolement efficace des cellules étoilées du foie, y compris des images représentatives de leur aspect morphologique et d'expression GFAP qui aident à définir l'entité de cellules étoilées.

Protocole

Souris C57BL / 6 doit être utilisé à ~ 20 semaines d'âge ou plus âgés. L'utilisation de souris mâles pesant 25-30g est recommandée. Le rendement des cellules étoilées peut être augmentée par l'alimentation des souris de la vitamine A régime enrichi pour 2 mois avant l'isolement de cellules étoilées. Environ 2x10 ⁵ cellules étoilées du foie peut être purifié à partir du foie d'un C57BL / 6 de la souris, alors que le rendement des cellules étoilées du souris Balb / c est considérablement plus élevé. Le protocole suivant est ajusté à 5 souris. Et soins des animaux d'expérimentation ont été effectuées en conformité avec soin des animaux et des protocoles appro....

Discussion

Cellules étoilées du foie réguler essentielles des processus physiologiques et physiopathologiques dans le foie. Par ailleurs, les cellules étoilées possèdent des propriétés présentant un antigène, les rendant une composante importante de la réponse immunitaire hépatique. Bien que les cellules étoilées hépatiques comprennent 10-15% du nombre total de cellules dans le foie, l'isolement de ces cellules est difficile en raison de leur localisation dans l'espace de Disse périsinusoïdales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif	Société	Catalogue No.
Passoire cellulaire 70μm	BD	352350
CaCl 2 x 2 H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Collagénase P	Roche	11249002001
DMEM	Gibco	11960
DNase I	Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21 à 031 cv-
EGTA	Fluka	3777
Sérum de veau fœtal	Gibco	16000
Le glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Tubes centrifugation en gradient	Greiner Bio-One	163160
HEPES	Gibco	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-Glutamine	Gibco	25030
MgCl 2 x 6 H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 7H 2 O x	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 x 2H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 x H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Pénicilline / streptomycine	Gibco	15140
Pompe péristaltique	Cole Parmer	HV-7523-70
Rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P4633
Pronase E	Calbiochem	7433-2
Tube de silicone	Masterflex	HV-96440-14
Pyruvate de sodium	Gibco	11360
Flacon de culture tissulaire (25cm 2)	BD	353108
Ensemble de perfusion Winged	Terumo	1SV27EL