Seven Steps to Cells Stellate

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von hepatischen Sternzellen aus Maus-Leber. Für Sternzellen Zellreinigung werden Maus-Leber verdaut In situ Und In-vitro- Nach Pronase-Kollagenase-Behandlung vor der Dichtegradientenzentrifugation. Diese Technik liefert hochreine Lebersternzellen.

Abstract

Hepatische Sternzellen sind Leber-residenten Zellen des sternförmigen Morphologie und sind in den Raum der Disse zwischen Leber sinusförmige Endothelzellen und Hepatozyten ^1,2 liegt. Sternzellen sind aus dem Knochenmark Vorstufen abgeleitet und bis zu 80% der gesamten Körper Vitamin A ^{1, 2.} Nach der Aktivierung, Differenzierung Sternzellen in Myofibroblasten um extrazelluläre Matrix produzieren und damit einen Beitrag zur Leberfibrose ^3. Auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Kontraktion kann myofibroblastischer Sternzellen regulieren den Gefäßtonus mit portaler Hypertonie ⁴ zugeordnet. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Lebersternzellen sind potente Antigen-präsentierende Zellen und können NKT-Zellen als auch konventionelle T-Lymphozyten ^{5 zu} aktivieren.

Hier präsentieren wir eine Methode zur effizienten Erstellung von hepatischen Sternzellen aus Maus-Leber. Aufgrund ihrer perisinusoidal Lokalisation, ist die Isolierung von hepatischen Sternzellen in einem mehrstufigen Prozess. Um Sternzellen zugänglich Isolierung aus dem Raum der Disse machen, Maus Leber in situ mit den Verdauungsenzymen Pronase E und Collagenase P. Nach Perfusion perfundiert werden, wird das Lebergewebe, um zusätzliche enzymatische Behandlung mit Pronase E und Collagenase P in unterzogen vitro. Anschließend findet die Methode den Vorteil der großen Menge an Vitamin A-Speicherung Fetttröpfchen in hepatischen Sternzellen. Diese Funktion ermöglicht die Trennung von sternförmigen Zellen aus anderen Leber Zelltypen durch Zentrifugation auf einem 8% Nycodenz Gradienten. Die hier beschriebene Protokoll ergibt sich eine sehr reine und homogene Population von Sternzellen. Die Reinheit der Präparate können durch Färbung für die Marker-Molekül sauren Gliafaserproteins (GFAP), vor der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie beurteilt werden. Zeigt ferner, wie die Lichtmikroskopie das einzigartige Erscheinungsbild der sternförmigen Lebersternzellen, dass große Mengen von Fetttröpfchen Hafen.

Zusammen bilden wir ein detailliertes Protokoll für die effiziente Isolierung von hepatischen Sternzellen, darunter repräsentative Bilder ihrer morphologischen Erscheinungsbild und GFAP Ausdruck, der den sternförmigen Zellen Einheit definieren helfen.

Protocol

C57BL / 6 Mäusen sollte bei ~ 20 Wochen alt oder älter verwendet werden. Die Verwendung von männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 25-30g wird empfohlen. Die Ausbeute an Sternzellen kann durch die Fütterung Mäusen ein Vitamin A angereicherte Diät für 2 Monate vor Zellisolation Sternzellen erhöht werden. Etwa 2x10 ⁵ Lebersternzellen kann aus der Leber von einem C57BL / 6 Maus gereinigt werden, während die Ausbeute der Sternzellen aus Balb / c Mäusen deutlich höher. Das folgende Protokoll ist auf 5 Mäusen angepasst. Tierpflege und Experimente wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss-Protokolle durchgeführt.....

Discussion

Lebersternzellen regeln wesentliche physiologische und pathophysiologische Prozesse in der Leber. Darüber hinaus besitzen Sternzellen Antigen-präsentierenden Eigenschaften, wodurch sie ein wichtiger Bestandteil der Leber Immunantwort. Obwohl Lebersternzellen 10-15% der gesamten Zellzahl in der Leber enthalten, ist die Isolation dieser Zellen Herausforderung aufgrund ihrer Lokalisation in der perisinusoidal Raum der Disse.

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um Lebersternzellen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name Of Reagent	Firma	Katalog Nr.
70μm Zellsieb	BD	352350
CaCl 2 x 2H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Collagenase P	Roche	11249002001
DMEM	Gibco	11960
DNase I	Roche	10104159001
DPBS	CellGro	21 bis 031-cv
EGTA	Fluka	3777
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gradientenzentrifugation Tubes	Greiner Bio-One	163160
HEPES	Gibco	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-Glutamin	Gibco	25030
MgCl 2 x 6 H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 x 7H 2 O	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 x 2H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 x H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140
Schlauchpumpen	Cole Parmer	HV-7523 bis 70
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P4633
Pronase E	Calbiochem	7433-2
Silikonschlauch	Masterflex	HV-96440-14
Natriumpyruvat	Gibco	11360
Zellkulturflasche (25cm 2)	BD	353108
Winged Infusion Set	Terumo	1SV27EL