本文描述了一种评估钩端螺旋体蛋白表面暴露的高效方法。该方法专门设计用于避免破坏钩端螺旋体细胞脆弱的外膜。该技术需要使用多个阴性对照，以评估外膜的完整性及抗体反应的特异性。
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摘要
摘要
细菌表面蛋白参与与宿主细胞的直接接触，并从环境中摄取营养物质1。因此，细胞定位可为细菌蛋白的功能作用提供线索。细菌蛋白的表面定位是鉴定参与致病机制的毒力因子的关键步骤。
钩端螺旋体膜的分馏方法2-5可能对某一类外膜蛋白（OMPs）具有选择性，例如脂蛋白与跨膜OMPs之间的区分，因此可能导致错误分类。这可能是由于结构差异以及它们与外膜结合方式的不同所致。脂蛋白通过其N端脂质部分（三个脂肪酸）与脂双层中的磷脂之间的疏水相互作用与膜结合6, 7。相比之下，跨膜OMPs通常通过呈桶状结构排列的两亲性β-折叠片整合到脂双层中8, 9。此外，某种蛋白存在于外膜中并不一定意味着该蛋白或其结构域暴露于细胞表面。已知螺旋体的外膜较为脆弱，因此需要采用温和的细胞操作方法，并加入亚表面蛋白对照，以评估外膜的完整性。
本文介绍一种免疫荧光检测法（IFA），用于直接评估完整钩端螺旋体表面蛋白的暴露情况。该方法基于抗原特异性抗体对钩端螺旋体表面蛋白的识别。此处，在抗体结合天然、暴露于表面的表位后，检测针对OmpL5410的特异性抗体。通过比较抗体对完整细胞与透化细胞的反应性，可评估蛋白的细胞分布情况，并判断其是否选择性地存在于钩端螺旋体表面。应使用针对一种或多种位于周质空间的亚表面蛋白的抗体来评估外膜的完整性。
表面IFA方法可用于分析任何可用特异性抗体检测的钩端螺旋体蛋白的表面暴露情况。该方法的有效性与局限性取决于所用抗体是否能够结合天然表位。由于抗体通常针对重组蛋白制备，可能无法识别天然、表面暴露蛋白的表位。尽管如此，表面IFA方法仍是研究完整细菌表面组分的有力工具。该方法不仅适用于钩端螺旋体，也可用于其他螺旋体及革兰氏阴性细菌。对于外膜蛋白（OMPs）表面暴露情况的更可靠结论，建议采用包括多种细胞定位方法在内的综合策略10。
方案
1. 固定 钩端螺旋体 到玻璃载玻片
- 钩端螺旋体（Leptospira interrogans）属于生物安全二级（BSL2）病原体。操作活细胞时需采取适当的防护措施，例如佩戴手套、穿上实验服，并在生物安全柜中进行移液操作。
- 将钩端螺旋体在EMJH培养基中培养，添加1%兔血清，在30°C条件下培养约6天，直至进入对数中期至对数后期（细胞密度为5 × 107 至 5 × 108 个细胞/mL）。
- 在室温下以约2000 × g离心7分钟，收集菌体。
- 通过抽吸去除上清液，并用含5 mM MgCl2的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）轻柔重悬菌体沉淀，调整终浓度为5 × 108 个细胞/mL。
- 将1 mL细胞悬液加入双孔玻片的每个孔中，在30°C孵育80分钟，使细胞贴附于玻片表面。
- 小心抽吸去除含有未贴附细胞的液体。
- 向每孔加入1 mL含2%多聚甲醛的PBS-5 mM MgCl2溶液，固定残留的完整细菌，在30°C孵育40分钟。这些玻片用于检测表面暴露的蛋白质。
- 对于检测亚表面蛋白的对照玻片，使用1 mL/孔的预冷无水甲醇（-20°C）固定并通透外膜，在-20°C孵育20分钟。甲醇具有多重作用：可通透外膜、使蛋白质变性，并将细胞固定于玻片上。
- 通过抽....
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讨论
我们的表面免疫荧光检测（IFA）技术类似于用于证明多种伯氏螺旋体15, 16和钩端螺旋体12, 17蛋白表面暴露的方法。本文所述表面IFA方法的细节经过优化，旨在尽量减少对细胞的操作，以维持外膜完整性，同时利用钩端螺旋体细胞易于黏附于玻璃载片的特性。该方法采用较低浓度的多聚甲醛（2% vs 4%），使用可稳定外膜的缓冲液（PBS + 5 mM MgCl2）进行洗涤，并且洗涤步骤少于先前发表的方案12, 17。此外，我们的表面IFA方法强调了对照实验的重要性，这些对照对于准确解读数据至关重要。该方法的一个局限性在于，需要有能够识别目标蛋白表面暴露表位的特异性抗体。在某些情况下，其他表面蛋白或脂多糖可能造成空间位阻，从而阻碍抗体与抗原的结合。尽管如此，表面IFA方法是一种相对简便的技术，可用于直接评估蛋白的表面暴露情况，既可单独使用，也可与其他技术（如免疫金标记、表面蛋白酶解等）联合应用。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国家过敏与传染病研究所的公共卫生服务基金资助项目 AI-34431（资助 D.A.H.）以及退伍军人事务部医学研究基金（资助 D.A.H.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双孔玻片 | Lab-Tek | 177380 | |
| 兔血清 | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira 增菌培养基 EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-二脒基-2-苯基-吲哚二盐酸盐 (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | 使用前平衡至室温 |
| Fisherfinest Premium 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| 荧光显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
参考文献
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. In....
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