Summary
Använda kvantitativ PCR, visar vi hur de väletablerade chick CAM-modell som kan användas för att kvantitativt analysera metastasering av humana tumörceller till avlägsna organ.
Abstract
Under metastaser cancerceller sprider sig från den primära tumören, invadera in i omgivande vävnader och sprida sig till avlägsna organ. Metastaser är en komplex process som kan innebära många vävnadstyper, span varierande tidsperioder, och förekommer ofta djupt inom organ, vilket gör det svårt att undersöka och kvantifiera. Dessutom är effekten av metastaserande process som påverkas av flera steg i metastaserande kaskad gör det svårt att utvärdera bidraget av en enda aspekt av tumörcellen beteende. Som en konsekvens är metastaser analyser som utförs ofta hos försöksdjur för att ge en nödvändighet realistiskt sammanhang där för att studera metastaser. Tyvärr är dessa modeller kompliceras ytterligare av deras komplexa fysiologi. Den kycklingembryo är en unik in vivo modell som övervinner många begränsningar att studera metastaser, på grund av tillgängligheten till chorioallantoic membran (CAM), ett väl vaskulariserad extra embryonal vävnad som finns under äggskal som är mottaglig för xenografting av tumörceller (figur 1). Eftersom den kycklingembryo är naturligt immunförsvar stöder CAM lätt att engraftment på både normala och tumörceller. Viktigast stöder aviär CAM framgångsrikt mest cancercellernas egenskaper, inklusive tillväxt, invasion, angiogenes och ombildningar av mikromiljö. Detta gör modellen exceptionellt användbar för utredning av vägar som leder till cancer metastasering och att förutsäga svaret av metastaserande cancer till nya potentiella läkemedel. Upptäckten av sprids celler genom artspecifika Alu PCR är det möjligt att kvantitativt bedöma metastaser i organ som är koloniserade av så få som 25 celler. Använda Human epidermoid Carcinom cellinje (HEp3) vi använda denna modell för att analysera spontana metastasering av cancerceller till avlägsna organ, inklusive ungen lever och lunga. Dessutom använder Alu-PCR-protokoll vi visar den känslighet och reproducerbarhet analysen som ett verktyg för att analysera och kvantifiera intravasation, gripande, extravasering, och kolonisering som enskilda delar av metastaser.
Protocol
1. Förbereda ägg för xenografting (spontana metastaser)
- Nylagda befruktade hönsägg inkuberas i en roterande inkubator för 10 dagar vid 100 ° C och 60% luftfuktighet. Äggen roteras fyra gånger varje timme.
- På utvecklande dag 10 äggen placeras på deras sida i ett ägg rack. En gås-ringad lampa eller annan lämplig ljuskälla används för att ljus äggen med skinande ljuset i äggskal i den trubbiga änden av ägget där airsac finns.
- Den chorioallantoic ven ligger och markeras. Detta ven ligger på toppen av äggskal där det är en korsning av flera stora blodkärl. Vid denna gren peka blodkärl droppar ner, bort från CAM och fäster embryot. En 1 cm fyrkantig låda dras med en penna på äggskal ungefär 1 cm från grenen punkt i venen. Området inklusive och runt torget är då rengöras med en bomullspinne fuktad med jod.
- Med hjälp av en roterande skärande verktyg (Dremel) försedd med en silikon karbid slipsten (Dremel del # 84.922) ett hål borras genom den trubbiga änden av ägget i Luftsäcken. Med denna samma verktyg ett hål borras inom de tidigare dras torget på toppen av ägget, stoppa kort i äggskal membranet. En 25-gauge injektionsnålen med en fin borr på slutet används för att göra ett litet hål i äggskalet membranet försiktigt så att inte riva den underliggande CAM. CAM därefter loss från äggskal membran i området kring torget med skonsam sugkraft skapas med en automatisk pipett hjälp försedd med en bit ¼ "tygon slang placeras mot hålet i airsac. Vid ansökningen sug, bör en luftficka under hålet på torget som innebär att den CAM framgångsrikt har tappats bort från äggskal. Efter CAM släpps är hålet i Luftsäcken och hålet ligger på torget nära chorioallantoic ven förseglad med en bit tejp laboratorium tejp. Äggen är sedan placeras i en stillastående inkubator vid 100 ° C och 60% luftfuktighet i väntan på transplantation av tumörceller. Se figur 1 för en sekventiell beskrivning.
2. Förbereda ägg för intravenös injektion (experimentell metastaser)
- Nylagda befruktade hönsägg inkuberas i en roterande inkubator för 12 dagar vid 100 ° C och 60% luftfuktighet. Äggen roteras fyra gånger varje timme.
- På utvecklande dag 12 äggen placeras på deras sida i ett ägg rack. En gås-ringad lampa eller annan lämplig ljuskälla används för att ljus äggen med skinande ljuset i äggskal i den trubbiga änden av ägget där airsac finns.
- Den chorioallantoic ven ligger och markeras. En 1 cm med 0,5 cm rektangel ritas med blyerts på äggskal direkt ovanför ven. Området inklusive och runt torget är då rengöras med en bomullspinne fuktad med jod.
- Ett litet fönster skapas i äggskal i den ritade platsen med hjälp av Dremmel borr (# 118). Fönstret tas bort för att avslöja den underliggande äggskal membran som sedan renderas transparent med droppe mineralolja. Se figur 5A till en grafisk avbildning.
- Vid denna punkt hålet i Luftsäcken och hålet finns på torget nära chorioallantoic ven är förseglad med en bit tejp laboratorium tejp. Äggen är sedan placeras i en stillastående inkubator vid 100 ° C och 60% luftfuktighet i väntan på att injicera tumörceller.
3. Förbereda tumörceller för ympning eller injektion.
- För xenografting, är de tumörceller lossnat från från sin kultur rätter med Trypsin / EDTA och tvättas med 10 volymer av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort eventuella media, trypsin, eller EDTA.
- För intravenös injektion, är odlade celler fristående med nonenzymatic cell-dissociation lösning, och tvättas med serumfritt DMEM. och)
- Celler räknas med en hemacytometer och suspenderade i PBS vid 1 till 40 celler / ml för ympning, eller alternativt suspenderade i serum-fri DMEM till 1 miljon celler / ml för intravenös injektion.
4. Transplantation av tumörceller till den nyligen exponerade CAM (Spontan metastaser)
- Äggen tas bort från inkubatorn och ett litet fönster klipps på platsen av de tidigare dras torg där ny luft ficka har bildats. Detta görs enklast med ett roterande verktyg utrustad med en kapskiva (Dremel verktyg med # 409 cirkulära kapskiva). Ett par nål-näsa peang används för att avlägsna den lilla delen av äggskal och exponera den underliggande CAM.
- Med hjälp av en bomullspinne (Fisher Brand # 23-400-001) CAM är skadad 5 gånger. Lite blod bör framgå på bomull. Omedelbart efter skada CAM, är 25μl av cellsuspensionen placeras på det skadade området. Det optimala antalet celler bestäms empirically men kan variera från 0.5X10 5 till 1x10 6. Fönstret i ägget sluter tätt med tejp och kycklingarna är stående i 10-15 minuter så att cellerna att bosätta sig. Efter 15 minuter äggen är tillbaka till den stationära inkubatorn.
- Tumörerna får växa i 5-8 dagar beroende på den specifika applikationen och vilken typ av tumör som används cellinje. Se figur 1 för en sekventiell beskrivning.
5. Intravenös injektion av tumörceller (Experimental metastaser)
- Med en 30 gauge 100μl spruta cellsuspension injiceras i allantois ven i varje embryo var äggen tillbaka till en stationär inkubator och stannade där i ytterligare 1-7 dagar.
- Vid olika tidpunkter, är lungan eller lägre CAM skördas från varje embryo och behandlats för detektering av tumörceller, som beskrivs nedan.
6. Skörd tumörer och vävnader brud
- En dissektion område är beredd. Analysen detekterar metastaserande celler genom att kvantifiera mänskligt DNA med en mycket känslig PCR-metod. Det är därför mycket viktigt att förhindra kontamination med exogena DNA. Dissektioner utförs i ett särskilt område och hela dissektioner verktygen rengörs mellan varje djur. För att förhindra korskontaminering av dina prover under dissektionen processen tre separata uppsättningar av verktyg används: en uppsättning för att skära ägget, en uppsättning för att ta bort den primära tumören och en uppsättning för att ta bort de inre organen. Dessutom är fyra tvätta containrar som används för sekventiell sköljning av verktyg mellan varje djur. I sekvensen dessa tvättar är: 1) dubbel destillerat vatten, 2) dubbeldestillerat vatten, 3) blekmedel, och 4) 70% etanol.
- Äggen tas bort från stationära inkubatorn och placeras på is i 15 minuter att söva och avliva djuren. Fönstren öppnas så att tumörerna blir synliga. Öppna fönstren större genom att ta bort en del av äggskal kan vara nödvändig. Den primära tumörer är opererande från CAM, vägas och behandlas för histologi.
- Den unge tas bort från äggskalet genom att skära skalet radiellt i lika stora delar. Embryot hälls från den skurna skal och överförs till en ren väger båten bröstet uppåt. Djuret är dissekeras med att använda en ny, ren uppsättning verktyg. Djuret öppnas genom att skära genom bröstbenet. När embryot är öppen, en bit av levern från antingen höger eller vänster lob samlas. De inre organen senare avlägsnas genom att dra försiktigt i matstrupen bifogas muskelmage och skära av visera som ansluter organ. För att samla in lungorna skära bröstkorgen öppnas bröstet plattan separeras och hjärtat tas bort. Vid denna tidpunkt är det möjligt att skära runt fyra sidor i lungan (den översta närmast huvudet åt vänster sida längs bröstkorgen, ner nära membranet och höger sida längs luftstrupen). För konsekvensens skull är det samma lunga som samlats in i varje djur. Skördas vävnadsprover förvaras vid -20 ° C för senare användning eller kan behandlas omedelbart för DNA-isolering.
7. Arvsmassans DNA isolering och kvantitativa PCR-analys
- Genomisk DNA extraheras från vävnader med Sybr Grön Extrahera-N-Amp Tissue PCR-Kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). Det extraherade DNA kan överföras till ett rent Eppendorf-rör och förvaras vid -20 ° C eller användas omedelbart. Det är viktigt att späda ut DNA 1:50 i nukleas fritt vatten innan du använder det i den efterföljande PCR-reaktionen. Alternativt kan DNA extraheras med valfritt antal standardprotokoll DNA-extraktion (Zijlstra et al., 2002).
- Mänskligt DNA detekteras i ungen vävnader med hjälp av kvantitativ PCR specifik för mänskliga Alu-sekvenser. Kvantitativ PCR, med Alu-specifika primers utförs med hjälp av SYBR gröna förstärkning från Exract-N-Amp kit. PCR kit levereras med en 2x-reaktionsblandningen innehåller SYBR grön, buffert, salter dNTPs, Taq-polymeras och Jumpstart Taq-antikroppen. Den reaktionsblandning består i en slutlig volym av 15μl, med 0.4μM av varje grundfärg. För de flesta fall med hjälp av extraherat DNA utspädd 1:50 kommer att ge kvantitativa data kan dock den optimala mängd templat-DNA behöver optimeras empiriskt. Kyckling GAPDH primers används som en intern kontroll PCR drivs under följande villkor för Alu-sekvenser: polymeras aktiveras vid 95 ° C i 2 min följt av 30 cykler vid 95 ° C i 30 sekunder, 63 ° C i 30 s. , 72 ° C under 30 s. Reaktionen förutsättningar för kyckling GAPDH är desamma som beskrivs för Alu men det kan vara nödvändigt att förlänga PCR till 40 cykler.
- Kvantitativ analys av metastaser utförs med hjälp av ΔΔCt metoden att jämföra experimentella grupper med en kontrollgrupp (Schmittgen och Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativt kan en standardkurva kan genereras med en spädningsserie av humana tumörceller extraherade med Extrahera-N-Amp kit (Zijlstra et al., 2002). Statistisk signifikans utvärderas med hjälp av Students t-test eller ANOVA-analys av kontroll och experimentella grupper.
8. Representativa resultat:
Figur 1. Kycklingen embryot metastaser modell. A) En fyra panel diagram som illustrerar utseendet på modellen i tvärsnittet vid viktiga steg: 1. Efter 10 dagars inkubation. CAM har nått nästan maximal storlek. Artärer och vener är tydligt synbar med allantois ven placeras mot toppen av ägget. 2. Ägget omedelbart efter att borra två hål i äggskal: en i airsac och en anslutning till fästpunkt för allantois ven. 3. Utseendet Efter en mild vakuum har använts för att evakuera airsac och släpp CAM. Tumörceller (blå) tillämpas på den tappade CAM. 4. Efter att låta ympade tumörceller att växa, är tumören tillsammans med vävnader från kycklingen embryot skördas för analys B) Ett serienummer skildring av modell:. 1. Ruva äggen., 2. Märkning platsen för allantois venen., 3. Borra hål i äggskal., 4. Tappa CAM., 5. Cutting en öppning för tumörceller ympning., 6. Tillämpning av tumörceller., 7. Kylning äggen på is före samla vävnad., 8. Skörd tumören efter 7 dagars tillväxt.
Figur 2. Histologi av CAM tumörer. Vävnader tas från tumören med chorioallantoic membran fastställdes i formalin, sektioneras och bearbetas med en trikrom fläck. A) HEp3 tumör efter sju dagar av tillväxt på CAM. B och C visar förstorade regioner från A visar både tumör och stroma. D) normaler CAM.
Figur 3. Kvantitativ longitudinell analys av metastaser. Varianter för huvud och hals cancer HEp3 med hög eller låg metastaserande förmåga (HEp3 M (Hög) och HEp3 M (Låg) respektive) analyserades med avseende på deras förmåga att sprida med hjälp av Alu PCR. Tio djur analyserades vid varje tidpunkt under hela 7 dagar. Dessa prover kvantifieras mot en standardkurva och därefter uttryckt som # cells/50mg vävnad.
Figur 4. Hämningen av spontana metastaser hos djur som behandlats med metastas hämmande antikroppar 1A5. Tumörer bildades med 5x10 5 HEp3 celler tillämpas på CAM på dygnet-10 embryon. Tre dagar efter applicering av tumörceller halv djuren behandlades med anti-CD151 antikropp 1A5. Lungorna från tumör-bärande djur skördades två dagar senare och utsättas för kvantitativ realtids-Alu PCR. Omvänt kvantitativ realtids-PCR för chGAPDH användes för att bekräfta förekomsten av motsvarande kvantiteter värd arvsmassans DNA (Den ΔΔCt metoden används för att jämföra de två grupperna kvantitativt (B).
Figur 5. Utvärdera arrestering, tillväxt och intravasation vid metastaserad kaskad. I grund och botten är metastaser till en sekundär orgel definieras av bidragen från tre aspekter: gripande, tillväxttakt, och graden av intravasation. Dessa kan kvantifieras med en kombination av experimentell metastaser (A) och spontan metastaser (B). Använda experimentella metastaser (A) arrestering definieras som antal celler detekteras 2hr efter injektionen. Överlevnad och tillväxt greps celler bestäms som förändringen i cell nummer 24 tim efter injektionen. Tillväxt definieras som graden av spridning under dagarna 3-7. Intravasation bestäms med hjälp av spontana metastaser (B) där antalet intravasated celler definieras som metastaserande börda som finns på dag 7 som överstiger det värde som förutsägs av tillväxten av metastaserande bördan finns på dag 6.
Figur 6. Visualisera expansion av metastaserande i CAM. HEp3 celler som uttrycker GFP var injiceras intravenöst på utveckling dag 12. Dag 1, 3 och 5 ett ägg offrades och en del av CAM avbildades med en fluorescerande stereo mikroskop. Den mörkgröna bakgrunden skapas av äggskal är kärlsystemet syns som svarta linjer, och tumörceller syns som ljusa gröna fläckar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den unge CAM har använts i årtionden som modellsystem för att studera olika aspekter av cancer biologi och metastaserande progression. Princip utvärdering av metastaserande förmågor har gjorts i denna modell av en mängd olika grupper, inklusive en analys av dvala (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski och Reich, 1983), vävnad ombyggnad Deryugina et al (2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) och metastaser (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Det fortsätter att vara en mycket attraktiv modell för cancerbiologi på grund av dess användarvänlighet, dess förmåga att acceptera implanterad, och dess låga kostnader (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990.). Använder mänskliga specifika Alu-baserade kvantitativ PCR (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002) vi visa förmåga att analysera metastaserande spridning av mänskliga cpidermoid cancer cellinje HEp3 (Figur 3). Dessutom vi visar nyttan av denna teknik i utvärderingen av terapeutisk hämning med metastaser hämmande antikroppar 1A5 (bild 4, (Testa et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).).
Förutom att kunna utvärdera metastaserande förmåga och behandlingssvar, även denna modell kan användas för att kvantitativt studera enskilda komponenter metastaserande kaskad (Zijlstra et al., 2002). Använda experimentella metastaser som intravenös injektion av tumörceller, ger denna modell för analys av cancercellen arrestering i den sekundära organ och deras senare tillväxt (figur 5a). Denna tillväxt kan användas för att förutsäga metastaserande bördan i ett längsgående spontan metastas-analysen (figur 5B). Intravasation bestäms med hjälp av spontana metastaser (B) där antalet intravasated celler definieras som metastaserande bördan finns på dag 7 minus värdet förutsägs av tillväxten av metastaserande bördan finns på dag 6.
Som en förlängning av de tekniker som redovisas här, utvecklade vi nyligen nya strategier för att visualisera tumören cellens beteende in vivo (Zijlstra et al, 2008.), Som använder fluorescerande nanopartiklar för att rikta tumören mikromiljön (Leong et al, 2010;. Lewis et al., 2006). Genom dessa framåt metoder kan nyttan av denna modell utnyttjas för att visualisera komplexa och dynamiska förändringar som stöder överlevnad, etablering och tillväxt av tumörceller. Dessa tekniker, tillsammans med den relativt låga kostnaden, nedsatt immunförsvar natur, användarvänlighet och flexibilitet i chick CAM gör denna modell värdefullt för bildbehandling och kvantitativ analys av cancer metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill känna igen Tyson Foods Inc. för generöst att ge de befruktade äggen. Shanna Arnold var avgörande under inspelningen av detta protokoll. Trenis Palmer stöddes av National Institutes of Health enligt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute). Detta arbete har delvis stöd av CCSRI Grant # 700.537 till JDL och NIH / GNI bevilja # CA120711-01A1 och CA120711-01A1 till AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
