Summary
Den intraluminal mellersta cerebral artär ocklusion (kortex) modellen är den vanligaste använda modellen bland experimentella ischemisk stroke modeller. Här kommer vi att visa hela modellen i detalj med guide med Laser Doppler flowmetry, och dess resultat representant.
Abstract
Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och den vanligaste orsaken till funktionshinder i världen, med en beräknad kostnad på nära $ 70 miljarder USA under 2009 1,2. Den intraluminal mellersta cerebral artär ocklusion (kortex) modellen utvecklades av Koizumi 4 1986 för att simulera detta effektfulla mänskliga patologi hos råtta. En ändring av kortex metoden senare presenterades av Longa 3. Båda teknikerna har ofta använts för att identifiera molekylära mekanismer för hjärnskador till följd av ischemisk stroke och potentiella terapeutiska metoder 5. Denna relativt icke-invasiv metod hos råttor har utvidgats till att använda i möss att dra nytta av transgena och stammar knockout 6,7. Att modellera fokal cerebral ischemi, är en intraluminal sutur avancerat via det interna halspulsådern för att täppa till basen på MCA. Dra tillbaka sutur efter en viss tid härmar spontan reperfusion, men sutur kan också vara permanent behållas. Denna video kommer att demonstrera de två stora metoder för att utföra intraluminal kortex förfarande i möss i en stegvis, samt att ge insikter för potentiella nackdelar och fallgropar. Den ischemisk hjärnvävnad kommer senare att färgas av 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) för att utvärdera omfattningen av hjärninfarkt 8.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Florida och är i överensstämmelse med "principen om Laboratory Animal Care" (NIH publikation nr 86-23, reviderad 1985).
1. Material
- Djur: Man C57BL / 6 möss (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) som väger 20-26 gram vid tidpunkten för operation.
- Anestesi:
- Anestesiapparaten: VetEquip inhalationsanestesi systemet (VetEquip Inc., San Francisco, USA).
- Inhalationsanestesi: Isofluran (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL).
- Kirurgiska instrument: SuperCut Iris sax, rakt (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA), Vannas mikro-sax, rakt (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA), Dumont peang (fin spets, 45 ° böjda tips, World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL, USA), bipolär koagulering enhet (High Frequency Exsickator 900, World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL, USA), mikro fartyg klipp (World precisionsinstrument Inc., Sarasota, FL, USA)
- Kirurgiska tillbehör: Sterila bomull tips, våtservetter, Slingervävnader tvättsvampar; Suture (7-0 Silk suturer och Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA), Tissue lim (Vetbond, 3M Company, St Paul, MN, USA), Kirurgisk skrubba : Bethadine, 70% etanol, och steril 0,9% koksaltlösning, ögonsalva (Puralube Vet Salva, Pharmaderm, Melville, NY, USA).
- Ocklusion sutur förberedelse för kortex:
- Glödlampor för MCA ocklusion: 7-0 kirurgisk nylon monofilament suturer (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA).
- Värmekälla för avtrubbning sutur tips (Thermal diatermi enhet, World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL).
- Flytande silikongummi (Silikon eltejp, World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL, USA).
- Kirurgiska / Granska mikroskop (Leica lupp MZ6).
- Fiberoptisk belysning (Fiber Optic illuminator FO1-150, TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA).
- Laser Doppler flowmetry (PeriFlux System 5000, Perimed, Stockholm, Sverige).
- Flexibel microtip (MT B500-0 Straight microtip, Perimed, Stockholm, Sverige)
- Temperatur parametrar:
- Rektala temperaturer skärm (BAT-12, World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL).
- Termisk filt (T / PUMP, TP600, Gaymar, NY, USA).
- Färgning och kvantitativ mätning av volym infarkt:
- 2% lösning 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (2% TTC, Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA).
- Möss hjärnan matris slicer (Zivic-Miller Lab. Inc., Allison Park, PA, USA).
- Digital kamera (V1253, Kodak Co, Rochester, NY, USA).
- Bild J programvara (ImageJ 1.42q mjukvara, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA).
2. Pre-kirurgiska åtgärder
- Före operationen, är de möss ligger under en 12:12 ljus / mörker-cykel med fri tillgång till vatten och gnagare chow.
- Suturer för kortex bereds av avtrubbning 1-2mm i sutur spetsen med värme och beläggning 3-4mm av sutur skaft från dess spets med flytande silikongummi, vilket gör det torka (7-0, tip diameter, 0,20-0.25mm, beläggning längd, 3-4mm, sutur längd 11-13mm). Sterilitet bör bevaras i alla av de ovan nämnda stegen.
- Efter vägning musen, är anestesi induceras med 4% isofluran hos en induktion kammare och bibehålls under förfarandet med 1,5-2% isofluran hos 30% O 2 och 70% N 2 O gasblandning via en ansiktsmask.
- Musen placeras i en liggande position på en kompress ligga på en temperatur-kontrollerad drift yta (termisk filt), huvudet pälsen är rakat.
- Smörjmedel oftalmologiska salva appliceras på både ögon och ögonlock är stängda för att hindra ögat uttorkning under det kirurgiska processen.
- En mittlinjen snitt (1 cm) görs på hud överliggande den calvarium från överlägsna NACK linje till nasion och huden dras i sidled för att anbringa ett flexibelt microtip (MT B500-0 Straight microtip, 0,5 mm diameter). Den microtip placeras vinkelrätt mot ytan av rätt parietal skallen (1 mm posteriort och 5 mm i sidled till bregma) att övervaka blodflödet i MCA territorium med laser Doppler flowmetry.
- Se till att den flexibla microtip är ansluten till skallen ordentligt innan djuret vrids till liggande ställning. Djurets hals placeras på en mjuk dyna och nosen hålls i noskon om bedövningen apparaten. Detta kommer att resultera i att ha tillräckligt med utrymme för de flexibla microtip.
- En rektaltemperatur sond förs in för att hålla en konstant temperatur djur kärna av 37 ± 0,5 ° C.
- Både framtassarna och hindpaws är tejpade för att de operativa plattformens yta, och svansen är tejpad på rektal röret. </ Ol>
- Under drift mikroskop, är en mittlinjen hals snitt med en sax mellan munröret och käken genom att försiktigt lyfta den lösa huden.
- Den parade underliggande submandibular körtlar är rakt på sak delas med den vänstra körteln kvar på plats. Rätt submandibular körteln är indragen cranially och säkrade tillsammans med sternocleidomastoideus.
- Den exponerade uppdelningen av omohyoid muskeln täcker halspulsådern slida är noggrant dividerat med pickups.
- Rätt gemensamma halspulsådern (CCA) är noggrant separerade och isolerade från vagusnerven och dess slida (finns lateralt CCA).
- Nedan de två kirurgiska metoder som har använts frekvent för att utföra MCA ocklusion avviker:
- Tre lös krage suturer (7-0 silke) är beredda runt höger CCA.
- Den externa halspulsådern (ECA) identifieras, isoleras och flamberats (2-3mm distalt bifurkation). Därefter kan delas med mikro-sax. För att undvika oavsiktlig perifera skador på BRÄNNING webbplats, bör kraften sättas till en med ström ratten. Detta är konsekvent för alla cauterizations.
- Tillräckligt spänning appliceras till den mest proximala kragen sutur på CCA för att täppa till blodflödet (permanent ligering). Flödet ocklusion verifieras av en ~ 50% minskning av utgångsvärdet kortikal genomblödning värden.
- Då ett fartyg klipp placeras strax innan CCA bifurkationen att undvika tillbakagående flöde vid arteriotomy.
- En arteriotomy sker mellan knyts ihop proximala sutur och fartyget klämma på CCA med mikro-sax (närmare ligering).
- Den värme-trubbiga silikonbelagd 7-0 nylon sutur introduceras via arteriotomy och avancerade tills den når fartyget klippet. De två återstående lösa kragen suturer är försiktigt åt runt CCA mellan arteriotomy och fartyget klippet för att undvika baksug läckage genom CCA, med försiktighet att inte traumatize kärlväggen, sedan fartyget klippet är tillbaka.
- ECA identifieras och skilj dem åt så mycket som möjligt (nära sin bifurkationen i flerspråkiga och maxillary artärer), flamberats (med makt satt till 1) och delas med mikro-sax.
- Två lös krage suturer (7-0 silke) är beredda runt proximala ICA strax ovanför CCA bifurkation.
- CCA är tillfälligt stängd med ett fartyg klipp. Flödet ocklusion verifieras av en ~ 50% minskning av utgångsvärdet kortikal genomblödning värden.
- Då ICA är tillfälligt stängd med ett fartyg klipp över de två lösa kragen suturer för att undvika tillbakagående flöde vid arteriotomy.
- En arteriotomy utförs med hjälp av mikro-sax i det reflekterade revisionsrätten nära stubben.
- Den värme-trubbiga silikonbelagd 7-0 nylon sutur introduceras via arteriotomy i ECA och avancerade tills den når tillämpas fartyget klippet i ICA. Den 2 lösa kragen suturer i proximala ICA är försiktigt åt runt proximala ICA för att undvika uppstötningar blodflödet genom ICA, med tillräcklig uppmärksamhet inte traumatize kärlväggen, sedan fartyget klippet är tillbaka.
- Den blockerade sutur sakta fram genom carotis interna (ICA) mot skallbasen tills ett milt motstånd känns. En samtidig minskning av cerebralt blodflöde värde i procent (= 80%) i förhållande till utgångsläget bekräftas av laser Doppler flowmetry. De 2 kragen suturer dras åt runt de infogade glödtråden.
- För övergående cerebral ischemi experiment är blockerade suturen dras försiktigt efter 45 minuter. Denna tidpunkt kan ändras för olika experimentella syften.
- Dra ut suturen glödtråden är arteriotomy webbplatsen stängda för att undvika postoperativa blödningar. I Koizumi metod innebär det säkert att dra åt kragen suturer runt CCA. I Longa s teknik är arteriotomy plats vid foten av ECA flamberats, då kragen suturer vid den proximala ICA lossas och tas bort för att återställa halspulsådern flödet.
- För att stänga snittet, är submandibular körteln och SCM som över det operativa fältet. Sårkanterna sedan approximeras med vävnad lim i livmoderhalscancer och områden hårbotten. Alternativt kan en absorberbara suturer eller metall häfta användas för att stänga såret speciellt när långsiktiga överlevnad djuret är avsett.
- Efter snitt stängning, får djuret 1 ml varm koksaltlösning subkutant som volym påfyllning. En dos av lämpliga analgetika (t.ex. buprenorfin vid 0,05-0,1 mg / kg) bör användas för att minimera djurens smärta och obehag under återhämtningsperioden. De animal tas bort från kirurgiska sviten och placeras i ett varmt uppvakningsavdelning / bur för att förhindra hypotermi, med fri och enkel tillgång till mjuk mat och vatten.
- ingen observerbar underskott
- misslyckande att utvidga kontralateral framtassarna (mild fokal neurologisk underskott)
- cirklande i en riktning kontralateral till infarkt (måttlig fokala neurologiska underskott)
- fallande i en riktning kontralateral till infarkt (allvarlig fokala neurologiska underskott)
- sänkt medvetandegrad utan spontan rörelse
- Efter 24 timmar av MCA reperfusion, är den efterlevande musen vägde, djupt sövda med 4% isoflorane, och offrade enligt godkänt protokoll.
- Hjärnan är försiktigt bort och placeras i en mus hjärna matris slicer, och hela hjärnan är koronalt sektioneras med 2 mm mellanrum.
- Sektionerna är nedsänkta i 2% TTC fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C i 20 minuter. Efter TTC färgning är infracted område som visas som en vit (ofärgade) vävnad intill rött tegel (viabla) vävnad (figur 1).
- Serial sektioner är fotograferade med en digitalkamera och ett område med infarkt mäts med bilden J-programmet.
- Området infarkt (vita, ofärgade), området med ipsilaterala halvklotet (vitt och rött tegel, målat), och den del av kontralaterala hemisfären (rött tegel, betsad) mäts för varje avsnitt. Volymen beräknas genom att summera de representativa områden i alla delar och multiplicera med slice tjocklek. Efter korrigering för ödem, är volymen för infarkt beräknas enligt följande 9:
Korrigerad infarkt Volym (CIV),% = [kontralaterala hemisfären volym - (ipsilaterala halvklotet volym - infarkt volym)] / kontralaterala hemisfären volym x 100
3. MCA ocklusion kirurgi:
Koizumi har 4 metod
Longa s 3-metoden
Resten av förfarandet i huvudsak är konvergent:
4. Post-Op neurologisk utvärdering
Efter att djuret återfår totalmedvetenheten, kan neurologiska bortfall utvärderas av en enkel skala (femgradig skala) enligt följande 3:
5. Färgning och kvantitativ mätning av hjärninfarkt volym
6. Representativa resultat
Efter ocklusion och reperfusion av MCA via vänster CCA att etablera övergående cerebral ischemi, är djur offrade och deras koronalt sektioneras hjärnor färgas med TTC att utvärdera omfattningen av infarkt (Figur 1).
Figur 1. TTC-färgade seriell koronalt hjärnan sektioner (2 mm) från möss utsätts för MCA ocklusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kortex modellen är en etablerad modell som replikerar cerebral ischemi i murina arter. Denna modell användes först på råttor och därefter anpassas till möss. Undvika craniectomy att eliminera inverkan av kirurgisk manipulation av blod-hjärnbarriären permeabilitet och intrakraniellt tryck är en fördel med denna teknik. Däremot kan många variabler, såsom stam-relaterade skillnader 10, storlek sutur spets 11, längd ocklusion 6, kroppstemperatur 12, anestesi 13, och andra faktorer leder till inkonsekvens i infarkt volymer i denna modell.
Det finns specifika tekniska detaljer som förtjänar omnämnande:
- Beläggning i slutet av suturen kommer att skapa en smidig och hanterbar sutur för blockerade MCA med minskad perforering risk.
- Fint särskilda säkra vagusnerven från angränsande artärerna så att den inte oavsiktligt begränsats i en krage sutur. Se till att använda två kragen suturer för att undvika retrograd blödning genom arteriotomy medan uppför blockerade suturen och dra dem försiktigt för att undvika traumatiska kärlväggen.
- Den pterygopalatine artär avviker från ICA efter CCA bifurkation. För att undvika avvikande toppen av stigande sutur i pterygopalatine artär i stället för ICA, ställ in din kirurgiska plattform för att hålla musen huvud och nacke i rak riktning. Denna avvikelse är gemensamt för båda Koizumi s och Longa är teknik, så försiktighet måste vidtas i antingen förfarande.
- Laser Doppler flowmetry är en metod för realtidsövervakning av blodflödet i olika anatomiska regioner och tillämpas i vårt experiment för att mäta blodflödet i det område av hjärnan som levereras via MCA. Det ökar avsevärt noggrannheten i suturen positionering, och garanterar därmed att få konsekventa resultat. Detta är en noteras fördel över mindre exakta metoder för att mäta längden på suturen ska infogas, som är mottagliga för störningar av anatomiska variationer.
- En tillfällig ökning av Laser Doppler flowmetry medan du sätter dina sutur genom CCA och ICA ser till att du rör dig i rätt riktning och nära till MCA ostium.
- Occipital artär som oftast beror på den proximala ECA (även om det ibland från ICA) i en posterolateral riktning. Det bör identifieras (i vissa knyts ihop fall) för att undvika senare missförstånd samtidigt som du sätter i suturen.
- För att minska variabilitet infarkt, håll musen kroppstemperaturen jämn under operationen och undvika hypotermi efter operation.
- Använd TTC färgning upp till 72 timmar efter kortex operation för att analysera infarkt volym på lämpligt sätt. För längre överlevnadstid poäng använda andra färgning metoder såsom Cresyl violett färgning för att bestämma infarkt storlek.
| Koizumi metod | Longa metod | |
| Plats för sutur insättning | Ipsilaterala Vanliga halspulsådern | Ipsilaterala Extern halspulsådern |
| Permanent arteriell offer | Vanliga Carotid och yttre halspulsåder | Extern halspulsådern |
| Risk för dödliga intraoperativ arteriell bristning / blödning | Mindre oro | Ökad oro |
| Möjlighet att sutur avleds till Pterygopalatine artär | Ja | Ja |
| Hur lång tid förfarandet | Generellt snabbare | Generellt längre |
| Laser Doppler Flowmetry: Procentuell minskning från utgångsvärdet | > = 80% | > = 80% |
| Laser Doppler Flowmetry: ocklusion / reperfusion trend |
|
|
Tabell 1. Jämförelse av två metoder för intraluminal mellersta cerebral artär ocklusion (kortex) hos möss
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
- Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
- Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
- Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
- Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
- Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
