Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal

Summary

El trasplante de precursores neuronales es una estrategia prometedora para la protección y / o reemplazar la pérdida / disfuncional neuronas cervical motor frénico en lesiones de médula espinal (LME) y el trastorno de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS). Ofrecemos un protocolo para la entrega de celulares a cuerno ventral de la médula espinal cervical en modelos de roedores de la ELA y la médula espinal.

Abstract

Compromiso respiratorio debido a la pérdida de neuronas motoras frénico es una consecuencia debilitantes de una gran proporción de los derechos humanos lesión de la médula espinal (LME) de los casos ¹ y es la causa última de muerte en pacientes con la enfermedad de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS) ^2.

La ELA es una enfermedad devastadora neurológico que se caracteriza por la degeneración relativamente rápido de la parte superior y las neuronas motoras inferiores. Los pacientes finalmente sucumben a la enfermedad en promedio 5.2 años después del diagnóstico debido a la parálisis respiratoria debido a la pérdida de las neuronas motoras innnervation frénico del diafragma ^3. La gran mayoría de los casos son esporádicos, mientras que el 10% son de la forma familiar. Aproximadamente el veinte por ciento de los casos familiares están vinculados a las mutaciones puntuales en el gen de varios Cu / Zn superóxido dismutasa 1 (SOD1) en el cromosoma 21 ^4. Los ratones transgénicos y ratones ^{4,5 6} llevar humana mutante SOD1 genes ^{(G93A, G37R, G86R, G85R)} se han generado, y, a pesar de la existencia de otros modelos animales de la pérdida de neuronas motoras, son actualmente los modelos más usadas de la enfermedad .

Lesión de la médula espinal (SCI) es un conjunto heterogéneo de condiciones que resultan de un trauma físico a la médula espinal, con el resultado funcional que varían según el tipo, localización y gravedad de la lesión ^7. Sin embargo, aproximadamente la mitad de los casos humanos de SCI afecta a las regiones cervical, lo que resulta en disfunción respiratoria debilitante debido a la pérdida de motoneuronas frénico y lesiones a descender los axones bulboespinal respiratorias ^1. Una serie de modelos animales de LME se han desarrollado, con el más comúnmente usado y clínicamente relevantes, siendo la contusión ^8.

El trasplante de las distintas clases de células precursoras neurales (NPC) es una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de lesiones traumáticas del SNC y la neurodegeneración, incluyendo la ELA y SCI, debido a la posibilidad de sustituir la neuroprotección perdido o proporcionar SNC disfuncionales tipos de células, y entregar los factores genéticos, de interés del ^9.

Los modelos animales de ELA y dos SCI pueden modelar muchos aspectos clínicamente relevantes de estas enfermedades, incluyendo la pérdida de las neuronas motoras frénico y el compromiso consecuente respiratorias ^10,11. Con el fin de evaluar la eficacia de las estrategias basadas en la APN sobre la función respiratoria en estos modelos animales de ELA y SCI, las intervenciones de celulares deben ser dirigidos específicamente a las regiones que contienen los objetivos terapéuticos relevantes, tales como las neuronas motoras frénico. Ofrecemos un protocolo detallado para multi-segmentaria, el trasplante de intraespinal de NPCs en la cervical de la médula espinal ventral materia gris de los modelos neurodegenerativos como la SOD1 ^G93A ratones y ratas, así como la médula espinal lesionada ratas y ratones ^11.

Protocol

Métodos

1. Preparación de células

Como ejemplo, vamos a describir el procedimiento para la preparación de las células gliales progenitoras ¹² para el trasplante, debido a nuestra experiencia con este tipo de células. Sin embargo, los detalles del protocolo, incluido el medio y el uso de la tripsina, por ejemplo, dependerá del tipo de célula particular que se use para el trasplante.

1. Pre-caliente todas las soluciones a los 37,0 ° C en un baño de agua.
2. Enjuague 2X matraz con HBSS. Añadir 5,0 mL/T-75 frasco de 0,05% de tripsina / EDTA. Incubar matraz durante 3 minutos en 37,0 ° C incub....

Discussion

Para estudios con ratones SOD1 ^G93A y ratas, la edad y el sexo coinciden con los animales dentro de un grupo, y distribuir los animales dentro de la misma camada de los diferentes grupos. Es preferible utilizar todos los animales del mismo sexo, tanto para la ELA y modelos SCI porque los procesos de la enfermedad pueden diferir entre hombres y mujeres, sin embargo, también puede ser útil disponer de suficientes animales de ambos sexos, para detectar posibles efectos específicos del sexo, como este fenómeno se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
HBSS	Gibco	14170
0,05% de tripsina	Gibco	25300
Inhibidor de tripsina de soja (opcional)	Sigma	T-6522
Acepromacina maleato (0,7 mg / kg)	Fermentación de Sanidad Animal
La ketamina (95 mg / kg)	Fort Dodge Animal Health
Xilazina (10 mg / kg)	Bayer
# 11 pluma quirúrgica hoja	Microscopía electrónica de Ciencias	72044-11
Bastoncillos de algodón (6 pulgadas)	Pescador	23-400-101
Rata de dientes con fórceps	Herramientas de Bellas Ciencia	Rata: 11023-15; Mouse: 11042-08
De tamaño mediano tijeras primavera	Herramientas de Bellas Ciencia	15012-12
Mini primavera tijera	Herramientas de Bellas Ciencia	15000-10
Gubia	Herramientas de Bellas Ciencia	Rata: 16121-14; Mouse: 16221-14
Microknife	Herramientas de Bellas Ciencia	10056-12
Los porta-agujas	Herramientas de Bellas Ciencia	12502-14
Sutura: 4-0	Vicryl	S-183
Staples: 9 mm	Autoclip	427631
Grapadora: 9 mm (Reflex # 203-1000)	Mundial de Instrumentos de Precisión	5000344
Bomba de agua tibia (T / bomba)	Gaymar	P / N 07999-000
Ciclosporina A: 250.0 mg/5.0 ml ampollas	Novartis / Sandimmune	NDC 0078-0109-01
FK-506	LC Laboratorios	F-4900
La rapamicina	LC Laboratorios	R-5000
Inyector	Mundial de Instrumentos de Precisión	UMP2
Micro 4 Controlador de la bomba Microjeringa	Mundial de Instrumentos de Precisión	UMC4
Micromanipulador	Mundial de Instrumentos de Precisión	Kite-R
10,0 l jeringa Hamilton	Hamilton	80030
Hamilton agujas: 33-calibre 45 de bisel °, 1 pulgada	Hamilton	7803-05
Vidrio 20,0 l pipetas microcapilares (opcional)	Kimble	71900-20