Summary
Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.
Abstract
Kromatin yapısı ökaryotlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesi için önemlidir. Bu süreçte, histon H3 ve H4 amino-terminal kuyrukları kromatin remodeling, DNA metilasyon ve kovalent değişiklikler temel rolleri 1-2 oynamaktadır. H3 ve H4 histon modifikasyonları, lisin ve arjinin metilasyon, lisin asetilasyonun, serin kalıntıları 1-2 fosforilasyon içerir . Bu modifikasyonlar gen aktivasyonu, baskı ya da uygun sinyalleri (mikrop-ilişkili moleküler desenleri, ışık, hormonlar, vs.) 3-7 algı sonra ifade daha hızlı ve sağlam bir aktivasyon destekler gen astarlanmalıdır bir devlet ya ilişkilidir .
Burada, biz, özel seçilmiş bitki genleri kromatin modifikasyonları güvenilir ve hassas tespiti için bir yöntem mevcut. Teknik değişiklik-spesifik antikorların 9,10 ile 8,9 formaldehit, ekstraksiyon ve kromatin, kromatin immunoprecipitation (ChIP) sonication (modifiye) histon ve DNA çapraz bağlanma dayalı, histon-DNA kompleksleri de-crosslinking gen belirli gerçek zamanlı kantitatif PCR. Yaklaşım, C 4 mısır 5,11 fotosentez ve Arabidopsis 3 sistemik bağışıklık ile ilgili özel histon modifikasyonları tespit için yararlı olduğu kanıtlanmıştır .
Protocol
1. Bitki materyali, Crosslinking
- Hasat 1-2g Arabidopsis 50 ml plastik tüp yaprak (6, 10 cm rozet çapa kadar) ve crosslinking tampon ile 40ml kadar doldurmak.
- Yaprakları, tampon yüzeyi üzerinde özel bir filtre süngeri sağ doldurma, örneğin dalmış muaftır emin olun. Sonra bir desikatöre tüpler yerleştirin.
- Vakum 10dk sızmak. Crosslinking durdurmak için her tüp 2M glisin 2.5ml eklemek ve glisin eşit dağılımını garanti tüpler ters.
- Vakum başka bir 5min sızmak ve bir elek üzerinde yaprakları hasat sırasında sıvı atın.
- Yıkama 1L, sonra bir bardak beher su, kağıt havlu ile iyice kuru yapraklar ile iki kez bırakır.
- Taze bir plastik tüp yaprakları toplayın ve sıvı nitrojen içinde dondurarak. Mağaza -80 ° C kadar kromatin izolasyon bırakır.
2. Kromatin izolasyonu
- Yapraklar kullanana kadar sıvı azot tutuldu harç ve dişilik organı ile zemin.
- 50-ml plastik tüp toz transferi ve 30ml ekstraksiyon tamponu # 1 geçici olarak askıya.
- Bir tepegöz çalkalayıcı 4 ° C'de 15 dakika inkübe.
- 50-ml taze bir plastik tüp içine dört kat miracloth boyunca Filtrat süspansiyon.
- 2.800 xg 20min için Spin 4 ° C
- Süpernatantı ve 1 ml tampon ekstraksiyon # 2 fırça ile pelet askıya. İlk tampon # 2 küçük bir hacim eklemek, sonra pelet bir boya fırçası ile askıya alma ve sonra tampon geri kalanını ekleyin.
- 4 12,000 xg'de 10 dakika süreyle bir 1.5mL mikrofuge'ye tüp ve spin süspansiyon transfer ° C
- Bu arada, 1.5mL ekstraksiyon tamponu # 3 içeren 2mL mikrofuge'ye tüpleri hazırlayın.
- Bükülmüş tüp (adım 2.7) süpernatantı ve ekstraksiyon tamponu # 3 300μL pelet askıya. İlk olarak, tampon # 3 küçük hacimli bir boya fırçası ile pelet askıya, ve sonra geri kalan tampon eklemek.
- Dikkatle pipetlemeyin adım 2.8 'de hazırlanan 1,5 mL tampon ekstraksiyon # 3 üst pelet (adım 2.9) askıya aldı. Iki faz karışımı olmayacak emin olun. 4 16.000 xg'de 1s için Spin ° C.
- Süpernatantı ve sonication tampon 300μL bir boya fırçası ile kromatin pelet askıya.
- DNA boyutu yaklaşık 400bp Sonotrode ile ya da ultrasonik banyoda kromatin sonikasyon. Sonicating zaman, emin kromatin yaklaşık 30 üzerinde ısıtılır ° C ısıya duyarlı çapraz bağları korumak için olun. Sonication süresi farklı sonication cihazlar arasında önemli ölçüde farklılık gösterir, çünkü deneysel olarak belirlenir. Rehberlik için, iki farklı aygıtlar için ayarları verilmiştir:
0.6mL mikrofuge'ye tüp Bandelin marka Sonotrode maruz kromatin% 25 güç, çevrim = 50 ayarları ile beş kez 20 patlamaları ile sonication. Bunu yaparken, bir buz banyosunda her 20 inci patlamaları sonra serin bir örnek .
Diagenode Bioruptor ultrasonik banyo ile sonication için, su banyosu ve buz ile doldurun ve 'yüksek' ayarı ile 1.5mL mikrofuge'ye tüpler 30 saniye on kat sonikasyon. Her 30 saniye sonra, başka bir 30 saniye boyunca serin örnekleri.
- Spin 4 16.000 g 5min için örnek sonicated ° C çözünmemiş malzeme hızlandırabilir. Süpernatant doğrudan immunoprecipitation için kullanılabilir. Alternatif olarak, numuneler, sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C ye kadar daha fazla kullanım saklanan şok olabilir.
3. Immunoprecipitation
- 40μL protein-A antikor bağlayıcı tampon agaroz ve 1.8mL. Içeren 2 ml mikrofuge'ye tüpleri hazırlayın Kromatin hazırlık 200μL (adım 2.13) ekleyin.
- Havai bir çalkalamalı 1s tüpleri inkübe edin.
- Protein-A agaroz boncuk atın ve immunoprecipitation için supernatant kullanabilirsiniz.
- Kromatin konsantrasyonu ('input') belirlemek için bir 40μL-kısım çıkarın.
- 30μL protein-A agaroz ve 400μL sonicated kromatin süspansiyon özgü reaktifler ve teçhizat aşağıdaki tabloda belirtilen değişiklik-spesifik antikor miktarı.
- Bir tepegöz çalkalayıcı 2.5h veya gece boyunca inkübe 4 ° C
- 440 x g. 2min için boncuk aşağı Spin
- Boncuk pelet 900μL (aşağıdaki listeye bakın) her yıkama tamponu ile yıkayın. Her tampon için, bir havai çalkalayıcı 4 ° C, 10 dakika süreyle tampon inkübe boncuk, sonra 440 xg'de 2min dönmeye supernatant atın ve bir sonraki tampon eklemek.
- Düşük tuz yıkama tamponu
- Yüksek tuz yıkama tamponu
- LiCl yıkama tamponu
- Te yıkama tamponu
- Son yıkamadan sonra, kalan herhangi bir tampon tamamen kaldırmak.
4. Histon ve DNA De-crosslinking ve çöktürülmüş DNA saflaştırılması
- Agaroz pelet ve 3.4 adım 40μl 'giriş' örnek bir vorteks karıştırıcı 5min için karışımı, spin örnekleri ve incu de crosslinking tampon 100μL ekle65 ° C gecede kesilmek.
- Ticari bir DNA veya PCR saflaştırma kiti ile DNA arındırın.
- Genellikle son sütun eluat 01:05 seyreltme 5μl gerçekleştirmek için yeterli geleneksel lokus spesifik gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (RT-qPCR).
5. Tamponların Tablosu
| Crosslinking tampon | |
| Sodyum bütirat | 10mM |
| Sakaroz | 400mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| ß-mercaptoethanol | 5mM |
| Formaldehit | % 3 (v / v) |
| Ekstraksiyon tamponu # 1 | |
| Sodyum bütirat | 10mM |
| Sakaroz | 400mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| ß-mercaptoethanol | 5mM |
| Komple proteaz inhibitörü | 1x |
| Ekstraksiyon tamponu # 2 | |
| Sodyum bütirat | 10mM |
| Sakaroz | 250mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| ß-mercaptoethanol | 5mM |
| MgCl 2 | 10mM |
| Triton X-100 | % 1 (w / v) |
| Komple proteaz inhibitörü | 1x |
| Ekstraksiyon tamponu # 3 | |
| Sodyum bütirat | 10mM |
| Sakaroz | 1,7 |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| ß-mercaptoethanol | 5mM |
| MgCl 2 | 2mm |
| Triton X-100 | % 0,15 (w / v) |
| Komple proteaz inhibitörü | 1x |
| Sonikasyon tampon | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25mm |
| EDTA-NaOH pH 8.0 | 5mM |
| SDS | % 0.5 (w / v) |
| Komple proteaz inhibitörü | 1x |
| Antikor bağlanma tampon | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 50mm |
| EDTA-NaOH pH 8.0 | 1mm |
| NaCl | 150mm |
| Triton X-100 | % 0,1 (w / v) |
| Düşük tuz yıkama tamponu | |
| NaCl | 150mm |
| SDS | % 0,1 (w / v) |
| Triton X-100 | % 1 (w / v) |
| EDTA-NaOH pH 8.0 | 2mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mm |
| Yüksek tuz yıkama tamponu | |
| NaCl | 500mm |
| SDS | % 0,1 (w / v) |
| Triton X-100 | % 1 (w / v) |
| EDTA-NaOH pH 8.0 | 2mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mm |
| LiCl yıkama tamponu | |
| Lityum klorür | 250mm |
| Nonidet-P40 | % 1 (v / v) |
| Sodyum desoxycholate | % 1 (w / v) |
| EDTA-NaOH pH 8.0 | 1mm |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mm |
| Te yıkama tamponu | |
| EDTA-NaOH pH 8.0 | 10mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 1mm |
| Decrosslinking tampon | |
| Tris-HCl, pH 6.8 | 62.5mm |
| NaCl | 200mm |
| SDS | % 2 (w / v) |
| DTT | 10mM |
6. Temsilcisi sonuçları:
Arabidopsis thaliana PR2 savunma gen ekspresyonu bir β kodlamaAntimikrobiyal aktivite 12, 1,3-Glukanaz benzothiadiazole (BTH), bitki hormonu salisilik asit 3 sentetik bir analog tarafından sağlandı. Şekil 1 PR2 ifade aktivasyonunun gösterir histon lizin kalıntılarının asetilasyon bir artış ile ilişkili PR2 organizatörü H3 ve H4. Nucleosome yoğunluğu 13 gen aktivasyonu sırasında azalır histon 3 değişmeyen bir bölge için bir antikor ile elde edilen sinyalin, histon asetilasyonu değerleri normalize edildi.
Şekil 1 BTH Arabidopsis PR2 organizatörü histon asetilasyonu neden olur. Bitkiler 100μM BTH veya ıslatılabilir toz kontrolü ile tedavi edildi. 72h sonra, yapraklar toplanmış ve kromatin izole edilmiştir. Asetilasyon özel antikorlar (resimde gösterildiği gibi) ile yağış sonrası elde edilen sinyal histon H3 değişmeyen bir etki alanı için bir antikor ile yağış elde sinyaline normalize edildi. Çöktürülmüş kromatin RT-qPCR tarafından belirlendi. Veri BTH tedavi yokluğunda histon değişiklik seviyeleri için standardize edilmiştir.
Discussion
Protokolde en kritik adımlar, DNA ve histon, yaprak malzemenin türü ve miktarı, malzemenin taşlama, ve kromatin sonication crosslinking. Bu konularda daha ayrıntılı bir tartışma için, refs bakın. 9 ve 10.
Sonikasyon ve crosslinking:
400bp hakkında parçaları sonication sırasında kromatin bozmak için önemlidir. Ise yetersiz sonication uzun kromatin parçaları bırakacaktır kapsayan sonication, DNA ve histon bozarak kromatin yok edecektir. Distal histon modifikasyonları test lokus yerel değişiklikler ayırt edilemez, çünkü bu yöntemin özgüllüğü etkileyebilir. Sonikasyon verimliliği en iyi örneklerinden DNA izole ve uzunluğu makaslanmış DNA agaroz jel elektroforezi ile belirlenmesi, Sonikasyon, de-crosslinking DNA ve histon önce ve sonra 20μL kromatin toplayarak test edilir. Kromatin hazırlık hala parçalanmış DNA görselleştirme etkileyebilir arıtma bu aşamada, büyük miktarda RNA içerdiğinden RNAse elektroforez önce numuneleri eklenmelidir. Makaslanmış Kromatin DNA DNA 400bp etrafında maksimum sinyal yoğunluğu olmayan makaslanmış Kromatin DNA 10kbp daha uzunsa bir karalama formları ise örnekleri, kromatin immunoprecipitation için yararlıdır.
Biz rutin olduğu gibi bırakır kromatin crosslinking için% 3 (v / v) formaldehit kullanır, ancak% 1 (v / v) formaldehit, çoğu durumda yeterli olabilir. Bizim ellerde, düşük formaldehit konsantrasyonları sonucu PCR reaksiyonlarında kısa sonication kez ve arka plan sinyalleri için izin verir. Ancak, yeterli miktarda formaldehit genellikle bağımsız deneyler arasındaki PCR sinyali düşük tekrarlanabilirlik. Bu düşük konsantrasyonlarda formaldehid ile yaprak yetersiz nüfuz etmesine bağlı olabilir. Bileşik süre ile polimerize eğilimi sık sık formaldehit hisse senedi alışverişi yapmak emin olun. Formaldehit çözümleri yalnızca yaklaşık bir ay boyunca stabildir ve bu dönemde pek metanol istikrar uzamıştır. Bu deneysel koşullar kurarken farklı formaldehit konsantrasyonları test etmek için tavsiye edilir.
Bitki materyali ve taşlama miktarı:
Yaprakların birbirine yapışmasını önlemek için tampon büyük bir hacim düşük miktarda yaprak malzeme sızmak için çok önemlidir. Yaprak formaldehit yetersiz infiltrasyonu genellikle sonuçları yapışmasını. Ayrıca, çok fazla bitki materyali miracloth doku gözenekleri bloke eder. Öğütme verimliliği önemli ölçüde mükemmel bir uyum ile bir havanda kullanarak bağlıdır. Biz rutin olarak ek sıvı azot yokluğunda bir sıvı azot soğutmalı havaneli ve harç ile öğütmek için üç kez 50 saniye kadar malzeme ince bir toz için zemin.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Alman Bilim Vakfı (DFG) ve Alman federal ve eyalet hükümetleri Mükemmellik Girişimi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein-A-Agarose | Roche Group | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche Group | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche Group | 11836145001 |
References
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
