Summary
尽管基因改造的最新进展，转染的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）保持一个反复无常的过程。据我们所知，系统和有效的方法，转染人诱导多能干细胞（iPSCs）尚未见报道。在这里，我们描述了可靠的协议，有效地转染和nucleofect人类iPSCs。
Abstract
转基因（GM）将继续是一个重要的工具，在研究干细胞生物学和提出潜在的临床应用人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）1。尽管仍有改进的在几个基因传递方法已被描述2-9，转染仍然是一个反复无常的过程对人类胚胎干细胞，尚未据报道，在人类诱导多能干细胞（iPSCs）。在这段视频中，我们展示了我们的实验室常规转染和利用质粒增强型绿色荧光蛋白（EGFP）记者nucleofects人类iPSCs。人类iPS细胞无饲养层培养适应和维护，以消除可能的饲养细胞转染，并允许稳定的转基因IPSC的克隆，转染后的有效选择。对于核转染，人类iPSCs预先处理与ROCK抑制剂11，胰蛋白酶消化成小的细胞团块，上馈线nucleofected和再接种在饲养细胞空调中，增强细胞恢复。 6小时后，可以得到转基因表达的人类iPSCs。抗生素的选择被施加后24小时和稳定的转基因品系1星期内出现。本协议的鲁棒性和重现性好，可用于人类iPSC的线，在不改变这些细胞的多能性。
Protocol
我们的协议，开始与人类iPSCs的方法，以适应无饲养层培养，GeneJuice（EMD）和人类iPSCs使用Amaxa公司nuclefector设备的核转染转染人类iPSCs的协议。
注：下列程序进行，在无菌层流罩。所有的媒体和解决方案是平衡至37℃或室温，然后再启动，除非另有规定。
1。馈线系统上建立人类iPSCs
人类iPSCs可以保持原来的饲养层细胞分裂，转移到Geltrex涂层的菜和维护馈线转染前两个通道。
- 在4°C过夜解冻Geltrex要准备Geltrex涂料，冷DMEM的解冻Geltrex 1:50稀释。混合轻轻的解决方案。
注：Geltrex，类似基底膜是可溶形式的基底膜MATR九纯化Engelbreth - 霍尔姆群（EHS）从小鼠肿瘤细胞。或者，基底膜可以用作一种细胞外基质，建立人类无馈线IPSC的文化。
- 覆盖培养孔与Geltrex溶液（1毫升，35毫米）的整个表面上。外套井Geltrex在37℃培养箱中培养1小时。
- 要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。
要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。
- 将添加10-15玻璃珠的细胞，轻轻地旋转板。加入2毫升的淘汰赛DMEM / F12，轻轻捣碎。细胞悬浮液转移到10毫升离心管中。
- 附带细胞以800rpm的转速在室温下3分钟。
- 吸液管从上清液，留下人类IPSC的颗粒完好无损。轻轻一抖管，分散细胞沉淀。
- 从涂好删除Geltrex。
- 轻轻重悬人类IPSC的颗粒在适当体积的STEMPRO。分发井间的进料器，取决于增殖率）。人类iPS细胞可以传代的分路比为1:2到1:6。
- 小心地放入5％CO 2培养箱中，涡流板仔细横跨孔中的细胞，以确保均匀分布。
- 饲料，直到细胞的细胞每天都准备好再次被分裂（当细胞达到80％融合）。
- 流路到新的Geltrex涂覆以及人类iPSCs（步骤1.3到1.9）中的分流比为1:2。小菌落形成上Geltrex转染前涂好且分布均匀。
2。 GeneJuice转染的人类iPSCs
细胞（6孔板上生长）应该是约40 -50％汇合的转染当天，以达到最佳的转染效率。这是没有必要改变的细胞培养基中，直到第二天。
- 准备的100微升KO-DMEM/F12在无菌的1.5毫升微量离心管。加入27微升GeneJuice转染试剂。拌匀。在室温下孵育5分钟。
- 加入4μg质粒DNA。管，在室温下孵育15分钟。质粒的选择是至关重要的最佳的转染效率。我们使用的质粒与CAG启动子5（pCAG-eGFP的）驱动的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。 CAG启动子是一个强启动子的转录活性在人类iPSCs，并因此可以被用来驱动在这些细胞中的转基因表达。在我们的手中，线性化的质粒转染效率似乎并没有影响。
- 加入GeneJuice-DNA混合物的细胞和旋流板。旋转板，在1200 rpm离心5分钟（'spinoculation'方法），以增加接触就做好了人类iPSCs转染混合物。
- 培养细胞在37及度C过夜。
- 监测转染效率的第二天。
- 对于稳定转染，改变介质的第二天与新鲜STEMPRO。 24 - 48小时后，加入适当的抗生素选择。
3。核转染的人类iPSCs
馈线或Geltrex上生长的人类iPSCs可以使用核转染。然而，我们强烈建议replating，nucleofected人类iPSCs到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），人包皮成纤维细胞（HFF）馈线，以确保高细胞活力和恢复。应使用至少2百万个细胞，以实现更高的后核转染的细胞的存活。
- 准备饲养层细胞的条件培养基（CM）培育人类iPSC的Knockout血清的更换（KOSR）的媒体与饲养层细胞过夜。收集CM，每24小时。
注：任何用于制备饲养层（如BLK6，CF1和MF1）的小鼠品系是适合用于R在CM。
- 核转染的当天，预治疗人类iPSCs用10μMROCK抑制剂至少为1小时。
- 准备人类干细胞nucleofector溶液的82μl的在无菌的1.5毫升微量离心管中。加入18微升补充1。拌匀。溶液在37℃下孵育5分钟。
- 预温暖的饲养细胞的条件培养基（CM）和0.25％胰蛋白酶/ EDTA至37℃。引擎盖下，prelabel 1无菌15毫升锥形管。
- 小心地取出媒体从人类iPSC的文化被nucleofected。轻轻洗2毫升1X磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，每孔细胞。吸取PBS。 0.25％胰蛋白酶，每孔加入1 ml。细胞在37℃下孵育3分钟。
- 细胞用1000毫升移液管尖轻轻捣碎。洗井的底部，以确保所有人类iPSCs完全脱离。细胞悬浮液转移到标记的15毫升锥形管。
注：胰酶消化成单个C英语学习者应严格避免。细胞应该只被抛下小由约三胞胎细胞组成的细胞团块，。在随后的处理的细胞小的细胞团块（小区三元组），将解离成单细胞。
- 加9毫升的MEF媒体灭活胰蛋白酶。附带细胞以800rpm，3分钟。小心吸出上清液，并留下细胞沉淀完好。
- 重悬细胞预热100μl的人干细胞nucleofector的解决方案，从步骤3.3。
- 将细胞转移到一个nucleofector的比色皿，用1毫升移液管尖端部。
- 到试管中的细胞悬浮液中加入4μg质粒DNA。细胞和DNA混合，轻轻回荡。轻按两次比色皿的引擎盖上表面。
- 将试管中到nucleofector持有人。方案B-016。 Nucleofect细胞按按钮X.
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- 从试管中使用所提供的巴斯德塑料吸管检索nucleofected细胞。恢复细胞，再悬浮到无菌的1.5毫升微量离心管中预热的CM和ROCK抑制剂。 10分钟，在37°C培养细胞，让细胞恢复。
- 逐滴传递细胞的饲养层上使用1毫升的移液枪枪头。孵育细胞于37℃培养过夜。
- 监测转染效率的第二天。为了获得稳定的转基因人类iPSCs克隆稳定表达的转基因，改变介质的第二天，CM和ROCK抑制剂。 24 - 48小时后，加入适当的抗生素选择。
4。代表性的成果：
Discussion
我们的协议简单，可靠，重现性好技术引进转基因人类iPSCs没有显着的毒性作用和细胞死亡。人类iPSCs应成更小的细胞团块，（5-10个细胞）传代，并镀上Geltrex在高密度（1:2），以确保最佳的转染效率在众多的小菌落。对于人类IPSC的线更容易发生分化和细胞死亡，更高数量的人类iPSCs（最多至4×10 6个细胞），应使用一个单一的核转染实验。瞬时转染1天之内产生大量的转基因表达人类iPSCs。稳定转染的iPSC的克隆通常出现在7天，应该是在三个星期内随时可以拿起这些转基因的殖民地。这里所描述的CAG启动子的使用确保无处不在表达绿色荧光蛋白记者。在这样的改善，我们的协议可以被输入到其他应用程序，包括过度表达，Conditional归纳，推导系特异性记者，短发夹RNA，siRNA敲除，基因打靶技术和同源重组。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在这个手稿中描述的工作成为可能，资金从美国加州再生医学研究所（CIRM）UCR干细胞核心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
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