आनुवंशिक संशोधन में हाल ही में प्रगति के बावजूद, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) अभिकर्मक एक सनकी प्रक्रिया बनी हुई है. हमारे ज्ञान करने के लिए, व्यवस्थित और कुशल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) transfect तरीकों को सूचित नहीं किया गया है. यहाँ, हम मजबूत करने के लिए कुशलतापूर्वक transfect और मानव iPSCs nucleofect प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
आनुवंशिक संशोधन करने के लिए स्टेम कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने में और आगे मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) 1 के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों की स्थापना में एक आवश्यक उपकरण के लिए जारी है. हालांकि कई जीन प्रसव के तरीके में सुधार 2-9 वर्णित किया गया है, अभिकर्मक hESCs के लिए एक सनकी प्रक्रिया रहता है, और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) में अभी तक नहीं किया गया है की सूचना दी. इस वीडियो में, हम प्रदर्शन कैसे हमारी प्रयोगशाला नियमित transfects और मानव iPSCs nucleofects एक बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन रिपोर्टर (EGFP) के साथ प्लाज्मिड का उपयोग. मानव iPSCs अनुकूलित कर रहे हैं और फीडर मुक्त संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा फीडर सेल अभिकर्मक की संभावना को खत्म करने और स्थिर ट्रांसजेनिक अभिकर्मक के बाद iPSC क्लोनों के कुशल चयन की अनुमति. के लिए nucleofection, मानव iPSCs रॉक 11 अवरोध करनेवाला, कोशिकाओं के छोटे clumps, सेल वातानुकूलित फीडर में भक्षण पर nucleofected और replated में trypsinized के साथ पूर्व इलाजसेल वसूली बढ़ाने के लिए मध्यम. ट्रांसजीन व्यक्त मानव iPSCs 6 घंटे के बाद प्राप्त किया जा सकता है. एंटीबायोटिक चयन 24 घंटे और स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों 1 सप्ताह के भीतर होने के बाद लागू किया जाता है. हमारा प्रोटोकॉल मजबूत और इन कोशिकाओं के pluripotency फेरबदल के बिना मानव iPSC लाइनों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है.
हमारे सरल, मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक में प्रोटोकॉल परिणाम प्रमुख विषाक्त प्रभाव और कोशिका मृत्यु के बिना मानव iPSCs में transgenes लागू करने के लिए. मानव iPSCs कोशिकाओं के छोटे clumps (5-10 कोशिकाओं) में passaged किया जाना चाहिए और उच्च घनत्व (1:2) में Geltrex पर चढ़ाया कई छोटी कालोनियों में इष्टतम अभिकर्मक दक्षता सुनिश्चित करने. कि भेदभाव और कोशिका मृत्यु होने का खतरा हैं मानव iPSC लाइनों के लिए, मानव iPSCs की अधिक संख्या (4 एक्स 10 6 कोशिकाओं) एक एकल nucleofection प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. क्षणिक अभिकर्मक परख transgene व्यक्त मानव iPSCs के 1 दिन के भीतर बड़ी संख्या उत्पन्न करता है. Stably ट्रांसफ़ेक्ट iPSC क्लोनों आमतौर पर 7 दिनों के भीतर दिखाई देते हैं, और इन ट्रांसजेनिक कालोनियों के तीन सप्ताह के भीतर उठाया जा करने के लिए तैयार होना चाहिए. सीएजी प्रमोटर का उपयोग यहाँ वर्णित EGFP संवाददाता की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है. इस तरह के सुधार के तहत, हमारे प्रोटोकॉल अन्य अनुप्रयोगों में खिलाया जा सकता है overexpression, ग सहित,onditional प्रेरण, वंश विशिष्ट संवाददाता लाइनों, shRNA या siRNA पछाड़ना की व्युत्पत्ति, जीन लक्ष्यीकरण और मुताबिक़ पुनर्संयोजन.
The authors have nothing to disclose.
काम इस पांडुलिपि में वर्णित UCR स्टेम सेल कोर के लिए पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) से धन के द्वारा ही संभव बनाया गया था.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
DMEM (high glucose) | Lonza | 12-741 F | |
Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
GeneJuice transfection reagent | EMD Biosciences | 70967 | |
Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercaptoethanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza | VAPH-5012 | |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercaptoethanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |