Summary
Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.
Abstract
FlexStation il Molecular Devices '3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E 'ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca 2 +-permeabile canali ionici e G-proteine recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca 2 + livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell'attivazione. In questo video, dimostriamo l'applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca 2 +-sensitive colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l'applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L'effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.
Protocol
1. Preparazioni di cellule in piastre da 96 pozzetti
Per le cellule HEK293 transitoriamente trasfected con TRPA1 umano cDNA
- HEK293 cellule sono coltivate per uno o due giorni in terreno minimo essenziale Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 mg / ml di glucosio (Thermo Scientific, SH3002201), integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Invitrogen, 15140-163). Il giorno della transfezione, la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 70-90%.
- Cappotto piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mg / ml in acqua distillata sterile) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per almeno 15 min. Lavare ogni pozzetto una volta con fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) senza Mg 2 + e Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La piastra può essere lasciato nel cofano coltura cellulare per qualche ora.
- Per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, diluire in 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,2 mcg cDNA in 25 microlitri OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Scalare fino proporzionalmente in base al numero di pozzi da transfettate con il cDNA stesso. Anche diluire in un apposito 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,4 microlitri Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 microlitri OPTI-MEM per ogni bene a essere transfettate. Questa scala fino in base al numero totale di pozzi per essere transfettate.
- Brevemente vortice del 2000 cDNA diluito e Lipofectamine e lasciarli stare alla temperatura ambiente per circa 5 min.
- Trasferire un volume uguale della Lipofectamine diluito 2000 per il tubo che contiene il cDNA diluito, vortex e lasciare che la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti a 2 ore. Durante questo tempo, trasferire il cDNA / Lipofectamine 2000 miscela al 49 microlitri / bene al poli-L-ornitina placca rivestita.
- Trypsinize le cellule HEK293 (Punto 1.1), conta la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule contessa automatizzati (Invitrogen, C10227), e trasferire una quantità desiderata di cellule (generalmente circa ~ 125,000-150,000 cellule / pozzetto) a 15 ml sterile conica con fondo provetta da centrifuga. Centrifugare a 1000 RPM x per 5 min. Risospendere le cellule a ~ 1,250,00-1,500,000 cellule / ml nel terreno di coltura DMEM, supplementato con 10% di siero siero fetale bovino, ma senza antibiotici.
- Dispensare 98 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto che contiene il cDNA-Lipofectamine 2000 utilizzando una miscela pipetter multicanale o il Dispenser Microplate Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 20-44 ore.
Per le cellule HEK293 che esprimono stabilmente TRPA1
- Seguire i passi da 1,2 a cappotto piastre a 96 pozzetti.
- La linea inducibile HEK293-hTRPA1 cella era generosamente fornito dal Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) e mantenuto nel mezzo come il wild-type cellule HEK293 (Punto 1.1) ma integrata con 5 mcg / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) e 50 mg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Quando densità cellulare raggiunge circa il 90%, trypsinize cellule, conta densità cellulare, e centrifugare la quantità desiderata di cellule a 1000 x RPM per 5 min. Risospendere le cellule ad una densità di circa 1.000.000 cellule / ml nel terreno di coltura stesso integrato con doxiciclina (Fisher, BP26535, 0,25 mg / ml).
- Dispensare la sospensione cellulare rivestito di lastre di poli-L-ornitina a 100 l / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 16 - 24 ore.
2. Soluzioni
- Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) è usato come soluzione extracellulare. Esso contiene (in mm): 137 NaCl, 5.4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 di glucosio, 10 HEPES, con pH regolato a 7,4 con NaOH 1N). - Fluo-4 tampone contiene 2 mM probenecid in HBSS. Fai 250 mm magazzino probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Diluire a HBSS con un rapporto di 1:125. Regolare il pH a 7,4 con 1 N HCl.
3. Celle di carico con Fluo-04:00
- Sciogliere 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) nel 912 microlitri di DMSO anidro per ottenere una soluzione stock di 1 mM. Il Fluo-4:00 soluzione madre può essere conservata a -20 ° C per almeno un mese.
- Mix 10 microlitri 1 mM-Fluo 04:00 con 10 microlitri Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) in DMSO) e poi trasferire l'intero contenuto di 5 ml Fluo-4 tampone (Step 2.2) integrato con 0,1% di albumina sierica bovina (Sigma, A9418).
- Lavare le cellule coltivate in piastre a 96 pozzetti (passo 1,7 o 1,10) con HBSS a 80 microlitri / ben 2 volte con una rondella di micropiastre (come ELx405TM da Bio-Tek).
- Aggiungere il Fluo-4 AM carico soluzione (Fase 3.2) a 50 microlitri / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek) e incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora.
- Lavare le cellule 3 volte con il Fluo-4 tampone (Punto 2.2.) Utilizzando la rondella micropiastre ELx405TM. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 80 ml di buffer di Fluo-4 test in ciascun pozzetto.
4. Preparazione del piatto composto
- Durante il periodo 1 cella di carico ora, preparare una serie di diluizioni 3x di agonisti (o antagonisti) di 3x delle concentrazioni finale desiderato nel buffer di Fluo-4 test.
- Pipetta 250-300 ml di soluzioni composto diluito ad una piastra composto da 96 pozzetti. Provvede alla traduzione della diluizioni seriali di un composto e dei controlli positivo e negativo corrispondente nella stessa colonna del piatto composto ogni volta che è possibile perché FlexStation 3 recita una colonna alla volta.
5. Di lettura targhe in FlexStation 3
- Accendere il sistema (FlexStation 3, computer e il SoftMax Pro 5.2 del software)
- Salva l'esperimento con un nuovo nome. Al set-up, scegliere la modalità FLEX e immettere i seguenti valori:
Protocollo n. 1, effetto agonista 
Protocollo n. 2, effetto antagonista 
- Inserire una nuova casella punta, piatto composto e la piastra di lettura per i vassoi appropriato in FlexStation 3 e fare clic sul pulsante "leggere". Il FlexStation 3 sarà letta una colonna alla volta e aggiungere composti nei punti di tempo programmato senza interrompere la lettura. Ci vogliono circa 3 minuti (5 min per il protocollo # 2) per finire di leggere una colonna e la macchina continua a leggere la colonna successiva, con aggiunte composto eseguito come programmato dall'utente al passo 5,2 fino a quando tutte le colonne vengono letti.
6. Analisi dei dati
- I dati sperimentali possono essere trattati direttamente con il SoftMax Pro 5.2 del software o copiato e incollato in qualsiasi programma di foglio di calcolo, come Microsoft Excel. Curva concentrazione-risposta di un acido TRPA1 agonista flufenamic (FFA), è costruito utilizzando i seguenti minimi quadrati routine di montaggio.
, Dove Y è la risposta osservata, Y max è la risposta normalizzata massima, C è la concentrazione del farmaco corrispondente, CE 50 è la concentrazione che evoca una mezza massima risposta, e n H è il coefficiente di Hill apparente. Concentrazione di inibizione curva per un presunto TRPA1 composto antagonista A è ottenuta utilizzando una concentrazione fissa di FFA (100 micron), e progressivamente aumentando la concentrazione di A. composto IC 50 Valore del composto A si calcola minimi quadrati al seguente equazione. 
, Dove Y è la risposta osservata e Y max è normalizzata risposta di picco, [Ant] è il composto corrispondente A di concentramento, IC 50 è la concentrazione di antagonista che produce la metà-massimale inibizione della FFA-risposta evocata e n H è la collina apparente coefficiente.
, Dove Y è la risposta osservata, Y max è la risposta normalizzata massima, C è la concentrazione del farmaco corrispondente, CE 50 è la concentrazione che evoca una mezza massima risposta, e n H è il coefficiente di Hill apparente. Concentrazione di inibizione curva per un presunto TRPA1 composto antagonista A è ottenuta utilizzando una concentrazione fissa di FFA (100 micron), e progressivamente aumentando la concentrazione di A. composto IC 50 Valore del composto A si calcola minimi quadrati al seguente equazione. 
, Dove Y è la risposta osservata e Y max è normalizzata risposta di picco, [Ant] è il composto corrispondente A di concentramento, IC 50 è la concentrazione di antagonista che produce la metà-massimale inibizione della FFA-risposta evocata e n H è la collina apparente coefficiente. 7. Rappresentante dei risultati:
TRPA1 è un +-permeabile canale catione Ca 2, l'attivazione dei quali porta a afflusso di calcio che può essere rilevato dal Ca 2 +-sensitive colorante, Fluo-4 (1-2). Una linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile è stato utilizzato per studiare la concentrazione-risposta di TRPA1 agonisti e antagonisti. Le cellule sono state caricate con Fluo-4 AM, posto in 80 microlitri della tampone, e leggere con FlexStation 3. Dopo aver registrato la fluorescenza di base per 30 s, 40 ml di una diluizione di serie del agonista TRPA1, FFA, ciascuno a 3 volte la concentrazione finale desiderata, sono stati aggiunti alle cellule attraverso un multi-canale pipetter incluso come parte del modulo fluidica di FlexStation 3. I cambiamenti fluorescenza sono stati monitorati per ulteriori 180 s. Le variazioni relative Fluo-4 fluorescenza per ciascun pozzetto sono stati espressi come ΔF = (F - F 0), dove 0 F e F sono i valori di fluorescenza, al momento di interesse e l'inizio della lettura, rispettivamente. Tracce rappresentante dei corsi tempo ai cambiamenti fluorescenza in risposta ad una serie di concentrazioni di FFA sono mostrati in fig. 1. Nota per le ultime quattro concentrazioni di FFA, anche se i livelli di risposta massima sono simili, la cinetica di attivazione è chiaramente più veloce al superiore alle concentrazioni inferiori FFA. Pertanto, per distinguere queste differenze, la concentrazione - relazione dose-risposta è stato costruito misurando i tassi iniziali (pendenza) di aumento di fluorescenza dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA (Fig. 2). L'effetto mezzo massimoconcentrazione ive (CE 50) di FFA è stato determinato in 55,4 mM (n = 3). Per testare la putativo TRPA1 antagonista, composto A, abbiamo effettuato un esperimento simile con protocollo n. 2 (punto 2). In questo caso, una serie di diluizioni del antagonista sono stati aggiunti a 30 s (40 ml di 3x concentrazione finale desiderata) e il FFA è stato aggiunto dopo 180 s (60 microlitri a 300 mM per una concentrazione finale di 100 mM). Composto A dose-dipendente ridotto la risposta delle cellule TRPA1 di FFA con una mezza massima concentrazione inibente (IC 50) di 4,3 mM (n = 3) (Fig. 2).
Figura 1. Concentrazione-dipendente l'attivazione di TRPA1 umani da parte di FFA. Le tracce sono aumentare FFA-evocato di fluorescenza nel tempo (risposta solo nei primi 60 s vengono mostrati per illustrare meglio la cinetica veloce del FFA-evocate risposte). Si informa che alle alte concentrazioni di FFA evocato aumento di fluorescenza con una cinetica molto più veloce rispetto a concentrazioni inferiori, anche se i livelli di picco di fluorescenza erano simili.
Figura 2 Concentrazione -. Relazioni risposta per FFA cambiamento indotto fluorescenza e composto A indotta inibizione della risposta FFA umani TRPA1 stabilmente espressi in cellule HEK293. Δ, la concentrazione - relazione dose-risposta di FFA è stata determinata misurando il tasso iniziale (pendenza) di aumento di fluorescenza normalizzata dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA. O, concentrazione-risposta di inibizione della FFA-evocata risposta di calcio da un presunto TRPA1 antagonista, composto A.
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Discussion
Intracellulare di Ca 2 + gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d'azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca 2 + intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca 2 +-permeabile canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di
Ca 2 + per i processi di cui sopra (9-13). Il test può essere usato anche per studiare la funzione della proteina G recettori accoppiati, molti dei quali, al momento dell'attivazione, portare ad un aumento intracellulare di Ca 2 + libero concentrazioni rilasciando Ca 2 + intracellulare di Ca 2 + negozi o attivando altre Ca 2 + permeabile canali ionici (14-16). FlexStation 3 fa uso di Ca 2 + coloranti sensibili, che danno luogo a una maggiore intensità di fluorescenza, o modifiche raziometrici, con l'aumento della concentrazione intracellulare di Ca 2 +. In questo articolo video mostra l'applicazione di FlexStation 3 nello studio di Ca 2 +-permeabile TRPA1 canali heterologously espressi in cellule HEK293. Anche se abbiamo usato solo le piastre a 96 pozzetti per la dimostrazione, gli utenti possono scegliere tra 96 - o 384-ben formato piastra passando il pipetters erogazione (8 - o 16 canali). Questa analisi fornisce un mezzo rapido di screening ad elevata capacità di agonisti e / o antagonisti ed è applicabile a molti altri Ca 2 +-canali ionici permeabili. Tuttavia, va notato che il dosaggio di calcio intracellulare è una misura indiretta di attività di canali ionici. Dettagliati studi di follow-up utilizzando registrazioni patch clamp di misurare direttamente corrente ionica che scorre attraverso la membrana delle cellule sono ancora necessari per trarre le opportune conclusioni.
Per ottenere affidabile qualità dei dati, le seguenti precauzioni devono essere prese:
- Per le cellule debolmente aderenti, come le cellule HEK293, rivestimento delle piastre è essenziale. Tuttavia, per le cellule fortemente aderenti, come ovaio di criceto cinese (CHO) o cellule HeLa, rivestimento non è necessario.
- E 'importante che la stessa quantità di cellule vengono seminate in ciascun pozzetto della piastra multi-bene e la densità delle cellule di ogni bene dovrebbe essere tra 90-100% confluenza al momento del test.
- Delicatamente dispensare liquidi nelle cellule e non disturbare le cellule durante il caricamento e lavaggio delle cellule.
- Probenecid viene aggiunto per evitare perdite colorante. Tuttavia, poiché probenecid ha anche effetto su alcuni canali ionici, si deve usare cautela quando si interpretano i dati ottenuti da esperimenti che includono probenecid nel tampone.
- Per determinare le concentrazioni composto nel piatto composto, considerare il fattore di diluizione per ogni bene in base al volume del buffer nel pozzo corrispondente della piastra campione prima e dopo l'aggiunta composto.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris e Olga Chumakova per il loro supporto. Il sistema a 3 FlexStation fa parte dello strumento UTHSC Imaging Cytodynamic. Ringraziamo anche Drs. Ardem Patapoutian e Michael Bandell dalla Scripps Research Institute e del Genomics Institute della Novartis Research Foundation (GNF) per fornire la linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile. La ricerca è finanziata in parte dalle concessioni dal NIH (GM081658 a MXZ) e Texas Medical Center Digestive Diseases Center (a SS) e Mission Connect / TIRR Foundation (a SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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