입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더 반영 생체내에 상황. 찬란 - 라벨 세포, 침략 모드와 세포를 선도 대 다음의 뚜렷한 공헌에 대한 자세한 정보 공촛점 이미지와 함께 매트릭스 침공 assays를 사용하는 것은 얻을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
암 강한 악의의 정의 특징은 침략과 전이 1입니다. 일부 암 (E. g. glioma 2) 건강한 조직을 주변에 지방 침공에서 질환과 사망의 근본 원인입니다. 다른 암에 대한 (E. g. 유방, 폐, 등.) 그것이 종양 세포가 일차 종양 질량의 이동 말초 사이트를 식민지 궁극적으로 기관 고장에 기여하는, 전이의 과정입니다, 그건 결국 병적 상태에 이르게하고 사망률 3. 그것은 침략과 전이는 암 사망자 4의 90 %에 대한 책임 것으로 추정되었습니다. 그 결과, 개선 진단과 치료 5 목적에 대한 분자 프로세스와 침략과 전이의 중요한 단백질 중재자을 식별에 강렬한 관심이있다.
암 과학자에 대한 도전은 충분히의 생체내 상황과 유사한 침공 assays을 개발하는 것입니다정확한 질병 모델링 6 설정하려면 다음과 같이하십시오. 2 차원 세포 운동성의 assays은 침략의 유익에 대해서만 부분입니다 또한 중요한 요소이다 계정 세포외 기질 (ECM) 단백질 리모델링 고려하지 않습니다. 최근 연구는 종양 세포 침공에 대한 우리의 이해를 세련되고 각 세포는 길쭉한 또는 반올림 모드 7 이동할 수 밝혔다. 또한, 암 8 확산에 특히 상피 특성을 유지하는 것을 매우 차별화된 종양의 세포가 긴, 시트와 클러스터로 나눠야하는 공동 침략의 기여보다 감사를,,, 거기되었습니다.
우리는 집단 침략 10 후보 단백질의 공헌을 조사를위한 세련된 방법 9 현재. 특히, 다른 형광 단백질을 표현하는 세포 공학 별도의 수영장으로, 그것은 molecularly 활동과 protei을 해부하다 할 수 있습니다NS는 다음과 세포에 필요한 그 간의 주요 세포에 필요합니다. RNAi의 사용은 실험적으로 개별 셀 침공뿐 아니라 공동 침략의 다른 위치에 관련된 프로세스를 분해하는 분자 도구를 제공합니다. 이 절차에서는 찬란 - 레이블 세포의 혼합물은 이전 Matrigel ECM 단백질 가득 Transwell 삽입의 하단에 도금되어 다음 필터를 통하여 Matrigel에 "이상"을 침공 수있었습니다. 입체 표현으로, 공촛점 이미징에서 얻은 Z 시리즈 이미지 스택의 재건 위치를 선도하는 대 다음에 찬란 - 레이블 세포의 표현의 총칭 침해 가닥 및 분석의 시각화를위한 수 있습니다.
프로토콜
1. 형광 단백질과 세포의 Retroviral 라벨링
- 0.25 X 10 6 세포에 따라 잘 6 잘 밖으로 플레이트 retroviral 포장 셀 (예 : 피닉스) 10% 태아 소 혈청 (FBS) / DMEM에 요리.
- 48시간 나중에 retroviral DNA와 Transfect 세포 세포는 제조 업체의 지시에 따라 Effectene를 사용하여.
- 나중에 중간 24시간로 두 번 우물 린스 후 10% 잘마다 FBS / DMEM의 1.5 ML를 추가합니다.
- pipetting 2 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송하여 중간 48시간 나중에 조직 문화에 패키지 바이러스를 수집합니다.
- 펠렛 모든 세포로 5 분 1,600 rpm으로 원심 분리기.
- -80에서 깨끗한 튜브에 뜨는하고 저장 제거 ° C.
- retrovirally transduced하는 세포 6 잘 요리 잘 당 1.5 × 10 5 세포에서 밖으로 도금 37 ° C 하룻밤에 humidified 배양기에 배치됩니다.
- 그 다음날, 세포와 광고에서 미디어를 제거D 각 잘 4 μl polybrene (2 MG / ....
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토론
Matrigel의 침공 assays는 전통적으로 chemoattractant 유발 운동성와 세포외 기질 단백질의 레이어로하고 하단에있는 필터를 통해 배치 전지로 설정되었습니다. Invasiveness는 필터의 아래쪽에 계산 될 수 얼마나 많은 세포의 기능으로 득점했다. 위에서 설명한 "반전"침략 분석과 함께 약간의 차이가 거의가 있지만, 그들이 Matrigel 통해 이동하고 침입 세포를 시각화하여 확인할 수 침략의 프로세스에 대한 상당히 자세한 정보가 있습니다. 예를 들어, 이외에 선도적인 비교 집단 침공 (그림 3C 및 3D)에 세포를 따라이 방법을 사용하여 검사 다르게 표시된 세포를 시각화 수있는 것은 세포가 단백질 수준 또는 subcellular 배포 스테인드, permeabilized, 고정 후 몇 군데 수 있습니다 . 이 방법의 해결 능력은 형광의 기준 신호 강도에 의해 제한됩니다NT 단백질은 두 개 이상의 색상이 몇 군데로했다 특히, 세포 이미징 장치의 감도를 표현. 염료 침묵 (DQ) 콜라겐 (p.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 연구에 대한 자금은 암 연구 영국에서이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| DMEM (Dulbecco의 변형 이글 배지) | GIBCO | 21,969 | |
| 태아 소 혈청 | PAA | A15 - 101 | |
| 페니실린의 스트렙토 마이신 | GIBCO | 15,140 | |
| 200 MM L - 글루타민 (100x) | GIBCO | 25050-032 | |
| Puromycin | 시그마 - 올드 리치 | P8833 | |
| 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | GIBCO | 25,300 | |
| Polybrene | 시그마 - 올드 리치 | AL - 118 | |
| Lipofectamine 2,000 시약 | Invitrogen | 11668019 | |
| 6.5mm Transwells, 8.0 μm의 기공 크기 | 코닝 | 3422 | |
| 완료 Matrigel | BD Biosciences | 354,234 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19,101 | |
| Propidium 요오드화물의 | 시그마 - 올드 리치 | P4864 | |
| 공촛점 microcope | Leica | SP2MP |
참고문헌
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironm....
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