Summary
Se presenta un análisis de flujo de alto rendimiento por citometría de determinar la actividad fagocítica de los antígenos específicos de los anticuerpos de muestras clínicas, la utilización de fluorescentes recubiertas de antígeno cuentas y una línea celular de monocitos que expresan múltiples receptores Fc-proporciona el uso de los receptores y las determinaciones de la actividad fagocítica en un estándar y forma reproducible por cualquier antígeno de interés.
Abstract
Anticuerpos impulsada por la fagocitosis es inducida a través de la participación de los receptores Fc de los fagocitos profesionales, y puede contribuir a la eliminación, así como patología de la enfermedad. Mientras que las propiedades de los dominios variables de anticuerpos han sido considerados críticos para la función in vivo, la capacidad de los anticuerpos para reclutar células del sistema inmune innato a través de sus dominios Fc se ha convertido cada vez más apreciado como un factor importante en su eficacia, tanto en el ámbito de recombinantes La terapia con anticuerpos monoclonales, así como en el curso de la infección natural o vacunación 1-3.
Es importante destacar que, a pesar de su nomenclatura como un dominio constante, el dominio Fc de anticuerpos no tienen una función constante, y está fuertemente modulada por las subclases de IgG (IgG1-4) y glicosilación en asparragina 297 4.6. Por lo tanto, este método para estudiar las diferencias funcionales de antígeno específico de anticuerpos en muestras clínicas facilitará la correlación de la olla fagocíticasdiferencial de anticuerpos contra la enfermedad del Estado, la susceptibilidad a la infección, la progresión, o el resultado clínico.
Además, esta función efectora es particularmente importante en vista de la capacidad demostrada de anticuerpos contra la infección por mejorar el acceso patógenos en las células huésped a través de receptores Fc-impulsado por la fagocitosis 7. Además, existe alguna evidencia de que la absorción de fagocitosis de complejos inmunes pueden afectar la polarización Th1/Th2 de la respuesta inmune 8.
Aquí se describe un ensayo diseñado para detectar diferencias en anticuerpos inducidos por la fagocitosis, lo que puede ser causada por diferencial de subclases de IgG, la estructura de glicanos en Asn297, así como la capacidad para formar complejos inmunes de antígeno de los anticuerpos específicos de un modo de alto rendimiento . Con este fin, una perlas fluorescentes micras están recubiertos con el antígeno, luego incubadas con anticuerpos de muestras clínicas, la generación de complejos inmunes antígeno fluorescente específico. Estos Antibody-opsonizadas cuentas se incuban con una línea celular de monocitos que expresan FcγRs múltiples, incluidos los inhibidores y activadores. Ensayo de salida pueden incluir la actividad fagocítica, la secreción de citoquinas, y los patrones de uso FcγRs, y se determinan de una manera estandarizada, haciendo de este un sistema muy útil para analizar las diferencias en la función efectora del anticuerpo dependiente de la infección y la protección mediada por la vacuna-9.
Protocol
1. Cultura células fagocíticas
- Cultura células THP-1 10 en RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% en forma de suspensión estacionaria en frascos T. La densidad celular debe mantenerse por debajo de 0.5x10 6 / mL con el fin de mantener niveles consistentes de expresión FcγR y rendimiento del ensayo.
2. Preparar el antígeno biotinilado
- Calcular la cantidad de sulfo-NHS kit de reactivos LC biotina necesario biotinylate el antígeno diana de interés de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Disolver el reactivo biotinilación en el agua e inmediatamente después, el monto calculado para el antígeno en una memoria intermedia que no contiene aminas primarias. Deje que la reacción tenga lugar durante 1 hora a temperatura ambiente, mezclando de vez en cuando.
- Retire el exceso de biotina, conjugada por el intercambio de búfer en una unidad Amicon concentración centrífuga de un corte de peso molecular adecuada para conservar la targeT antígeno. Añada la muestra a la cámara superior de la unidad de concentración y añadir PBS para obtener un volumen total de hasta 15 ml línea de llenado. Centrifugar a 4000 xg para llevar el volumen hasta aproximadamente 1,5 ml. Repetir este proceso dos veces se eliminará el 99% de la biotina libre para asegurar el revestimiento máximo de antígeno a los granos.
3. Prepare bolas de antígeno saturadas
- Lavado de 100 l de una cuentas neutravidin mm fluorescentes dos veces en 1 ml 0,1% PBS-BSA tras hacer un trompo en una microcentrífuga a alta velocidad. Volver a suspender las bolas de lavado en 100 l de PBS-BSA, y alícuota en 10 tubos.
- Para determinar las condiciones de antígeno de recubrimiento que saturan las cuentas, se combinan 10 ul de la suspensión de bolas lavado con diferentes concentraciones de antígeno con biotina en dos veces los pasos. Incubar toda la noche a 4 ° C en un tubo de microcentrífuga en un rotor.
NOTA: La saturación de cuentas debe ser determinado experimentalmente. Esto se puede lograrmediante la identificación de cuentas de recubrimiento condiciones que producen la fagocitosis máxima cuando cuentas son posteriormente opsonizadas con un anticuerpo monoclonal de control.
- Quitar antígeno desatado por lavado con 1 ml de PBS-BSA y centrifugar a alta velocidad hasta que gotas se precipitan. Quitar PBS-BSA y repetir.
- Resuspender el antígeno revestida de piedras en un volumen final de 1 ml en PBS-BSA. Cuentas se pueden almacenar hasta por una semana a 4 ° C antes de su uso.
4. Prepare las muestras de anticuerpos
- Las muestras clínicas de anticuerpos puede ser purificado de plasma utilizando un gel de Melón IgG kit de purificación de acuerdo a las instrucciones del fabricante. IgG purificada se puede almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
NOTA: las precauciones adecuadas en cuanto al manejo de muestras humanas siempre han tenido.
- Determinar la concentración de anticuerpos purificados por absorbancia a A280, y diluir las muestras de 1 mg / ml en PBS.
- Prepare postulanive y negativos de anticuerpos monoclonales de control mediante la dilución de 1 mg / ml en PBS.
5. Revestimiento del Experimento
- Volver a suspender el lavado, el antígeno de una solución saturada de cuentas preparados anteriormente por agitación, y la transferencia de 10 l en cada pocillo de un fondo redondo de 96 pocillos. Se debe tener cuidado para agitar continuamente la suspensión de cuentas para asegurar el mismo número de bolas fluorescentes se añadieron a cada pocillo.
- Añadir diferentes concentraciones de los anticuerpos de interés para cada pozo, creando una curva dosis-respuesta para cada anticuerpo. Las concentraciones óptimas difieren entre las muestras en función de los títulos de anticuerpos presentes, sino un rango de 0,01 a 100 mg / ml concentración final será ofrecer una buena cobertura y permitir la identificación de la gama de concentraciones de interés. Asegúrese de que los anticuerpos se añaden los volúmenes de no más de 20 microlitros.
- Incubar las muestras de granos y de anticuerpos durante 2 horas a 37 ° C para permitir que los anticuerpos opsonizan las cuentas. </ Li>
- Preparar una suspensión de células THP-1 a 2,5 x 10 5 células / ml, y añadir 200 l de esta suspensión a cada pocillo, para un total de 5 x 10 4 células THP-1 en cada pocillo.
- Incubar toda la noche a 37 ° C, 5% de CO 2, en una incubadora fija, las células que permite y cuentas para que sedimenten por gravedad.
NOTA: La señal de ruido puede ser mejorado mediante la determinación del óptimo de bolas: anticuerpos: THP-1 relaciones de la célula para una determinada fuente de antígenos y anticuerpos.
6. El análisis de citometría de flujo
- Sacar 100 l de sobrenadante de cada pocillo con cuidado de no perturbar el sedimento celular. Sobrenadante puede ser salvado si las determinaciones de la secreción de citocinas u otros análisis son deseados.
- Para la fijación, añadir 100 ml de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y una pipeta para volver a suspender y mezclar las células.
- Análisis de citometría de flujo alto rendimiento se puede realizar utilizando una BD LSR II equipado con un lector de placas de HTS.
- Programa de software para mezclar cada pocillo tres veces (100 l de volumen de mezcla) y analizar los 30 l, o por lo menos 2.000 eventos de la célula, de cada muestra.
- Los datos recogidos pueden ser analizados en FlowJo o software equivalente. Métricas útiles incluyen el porcentaje de + cuentas, o células fluorescentes, lo que proporciona una medida del número de células fagocíticas presentes, así como la intensidad de la fluorescencia de las células fagocíticas, que proporciona una medida de la cantidad de cuentas fagocitados. Multiplicando estos valores genera un sistema integrado de intensidad media fluorescente o iMFI.
- El número medio de cuentas de fagocitados por cada célula fagocítica se puede calcular dividiendo el iMFI por la media de fluorescencia de una perla.
7. Resultados representante
Debe haber una clara diferenciación de las muestras de anticuerpos de los sujetos afectados y no afectados. Figura 1A presenta los histogramas FACS de una muestra de anticuerpos a partir de un negativo del VIHnegativo (rastro negro) y un sujeto VIH positivo (traza gris), y demuestra la fagocitosis aumento impulsado por la presencia de antígenos específicos de los anticuerpos.
Sensibilidad óptima de la prueba depende de la saturación de las cuentas con el antígeno con biotina. Figura 1B se presenta la fagocitosis observado cuando recubiertas con diferentes cantidades de antígeno se opsonizadas con tres anticuerpos monoclonales de control (incluyendo un anticuerpo no vinculante, triángulos), y establece 2μg antígeno / l perlas como una concentración de saturación de este antígeno.
Una curva dosis-respuesta se presenta en la Figura 2, y demuestra la capacidad diferencial de las muestras de anticuerpos sujeto para inducir la fagocitosis en un rango de concentración de anticuerpos de 0,05 a 5 mg / ml. Esta fagocitosis diferencial puede ser conducido por cualquiera de las diferencias en los títulos o las propiedades de dominio Fc como subclases de IgG y el estado de glicosilación.
Cuando células THP-1 i sonMaged por microscopía de fluorescencia, hay una clara evidencia de la fagocitosis de perlas. Figura 3 se presentan dos imágenes fijas de 63x células THP-1 después de la incubación con el anticuerpo opsonizadas (verde) y no opsonizadas cuentas (rojo), lo que demuestra la falta de absorción de fagocitosis de la ausencia de anticuerpos. Cuando microscopía lapso de tiempo se realiza la absorción fagocíticas anticuerpos específicos de cuentas fluorescentes es aún más sorprendente (Movie 1, 20 aumentos).
El trabajo previo ha confirmado la internalización de las cuentas asociadas a las células, y los experimentos con los monocitos primaria han acordado así con las puntuaciones fagocíticas (valores iMFI) en este ensayo de alto rendimiento (datos no mostrados).
Figura 1. Ensayo de Control de Calidad. 1A, histogramas de citometría de flujo de la fagocitosis de una muestra de anticuerpos de un sujeto VIH negativo (negro traza) y un sujeto VIH positivo (rastro gris).1B: Determinación experimental de las condiciones de recubrimiento óptimo de cuentas por un antígeno de la muestra. De antígenos específicos de los anticuerpos monoclonales (círculo, cuadrado), demuestran la fagocitosis máximo de bolas recubiertas con> 2 mg de antígeno / l de cuentas, mientras que un anticuerpo de control (triángulo) demuestra que no hay actividad fagocítica.
Figura 2. Fagocitosis curva dosis-respuesta. Las muestras clínicas de anticuerpos de VIH positivo (tratados, no se trata, y que muestran el control de la replicación viral en ausencia de terapia anti-retroviral) y VIH-negativas fagocitosis disco temas de la gp120 (envoltura del VIH) recubiertas de manera diferenciada.
Figura 3. Internalización eficiente. Microscopía confirma la internalización de los anticuerpos opsonizadas cuentas (verde), mientras que los no opsonizadas cuentas permanecen en Sollución (63x aumentos).
Movie 1. Time-lapse microscopía de anticuerpos impulsada por la fagocitosis se llevó a cabo en el transcurso de 14 horas y permite la visualización de la actividad fagocítica de las células THP-1 utilizado en el ensayo de alto rendimiento. Cuentas verdes fluorescentes de anticuerpos opsonizadas, rojo perlas fluorescentes proporcionan un control negativo. Haga clic aquí para ver la película.
Discussion
El ensayo se describe aquí permite el análisis de alto rendimiento de la actividad fagocítica de las muestras clínicas de anticuerpos mediante la utilización de una línea celular de monocitos a largo utilizado para estudiar los procesos de fagocitosis 10 y placa basada en citometría de flujo automático. Este ensayo es una ventaja sobre los demás en su capacidad para caracterizar con precisión de antígenos específicos de subgrupos de anticuerpos, lo que permite no sólo para el estudio de las diferencias en la fagocitosis impulsada por la enfermedad de los anticuerpos específicos de distintas materias, sino también el estudio de las especificidades de antígeno múltiples dentro del mismo tema. Debido a que la contratación de anticuerpos de las células efectoras innata, como monocitos y otras células presentadoras de antígeno fuerte impacto pronóstico de la enfermedad 11-13, y es biológicamente variable dependiendo de la geometría de anticuerpos, las subclases de IgG, y glicosilación en Asparagine297 del dominio Fc 14-16, este método ofrece para evaluación de un mecanismo fundamental de acción de anticuerpos. Además, debido a los anticuerpos de Medifagocitosis ated es explotado por algunos agentes patógenos durante el curso de la infección 7,17,18, este ensayo es muy prometedora en la evaluación del proceso de mejora dependiente de anticuerpos, y pone de relieve la naturaleza dual de la fagocitosis como potencialmente protectores, así como potencialmente perjudiciales anticuerpos actividad.
El ensayo descrito puede ser utilizado para analizar los anticuerpos de muestras clínicas de las poblaciones de pacientes, sino también de los vacunados, y puede ser adaptado para utilizar en lugar de suero IgG purificada. Además, la secreción de citocinas en respuesta a la fagocitosis puede ser analizada desde el sobrenadante del cultivo, y la influencia de FcR específicos se puede determinar mediante el uso de FCR-bloqueo de anticuerpos, lo que permite no sólo las diferencias en la potencia de fagocitosis por determinar, pero aguas abajo de señalización de eventos, con una visión en el mecanismo, y puede ayudar a resolver y refinar la comprensión de este mecanismo inmunológico.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer la financiación de los NIH-02S1 3R01AI080289, y la Universidad de Harvard Center for AIDS Research Scholar de becas en los NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 |
|
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | EMD Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
| FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
| Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |
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