Summary
Cultured Muskelzellen sind ein unzureichendes Modell zu rekapitulieren innervierten Muskel
Abstract
Humane primäre Muskelzellen aneurally in Monoschicht kultiviert sich selten spontan, weil, in Abwesenheit eines Nerven-Komponente, Zelldifferenzierung begrenzt ist und Motorneuronen Stimulation fehlt 1. Diese Einschränkungen erschweren die in vitro-Studie von vielen neuromuskulären Erkrankungen in kultivierten Muskelzellen. Wichtig ist, dass die experimentellen Randbedingungen von einschichtigen, kultivierten Muskelzellen durch funktionelle Innervation der Muskelfasern mit Rückenmark Explantate in Co-Kulturen überwunden werden.
Hier zeigen wir die verschiedenen Schritte, um eine effiziente, ordnungsgemäße Innervation von humanen primären Muskelzellen erzielen, was zu Differenzierung und Kontraktion Faser nach dem Verfahren von Askanas 2 entwickelt abzuschließen. Dazu werden Muskelzellen mit Rückenmark Explantate von Rattenembryonen bei ED 13,5 co-kultiviert, mit der Spinalganglien noch an das Rückenmark Scheiben befestigt. Nach ein paar Tagen, fi der MuskelMitglieder starten zu kontrahieren und schließlich zu quergestreiften durch Innervation durch funktionelle Neuriten Projektion aus dem Rückenmark Explantate, dass zu den Muskelzellen verbinden. Diese Struktur kann für viele Monate aufrechterhalten werden, einfach durch einen regelmäßigen Austausch des Kulturmediums.
Die Anwendungen dieser sehr wertvolles Werkzeug sind zahlreich, wie es ein funktionierendes Modell für multidisziplinäre Analysen der menschlichen Entwicklung der Muskulatur und Innervation darstellt. In der Tat tritt eine komplette De-novo-neuromuskulären Synapse Installation in einer Kulturschale, so dass eine einfache Messung vieler Parameter bei jedem Schritt in einer grundlegenden und physiologischen Kontext.
Nur um ein paar Beispiele, genomische und / oder Proteom-Studien zitieren kann direkt auf die Co-Kulturen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Vor-und postsynaptischen Effekte gezielt und separat an der neuromuskulären Synapse beurteilt werden, da beide Komponenten aus verschiedenen Spezies stammen,Ratte und Mensch, beziehungsweise. Der Nerv-Muskel-Co-Kultur kann auch mit menschlichen Muskelzellen von Patienten mit Muskel-oder neuromuskuläre Erkrankungen 3 isoliert durchgeführt werden, und kann somit als Screening-Instrument für Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden. Schließlich wird keine spezielle Ausrüstung, sondern eine regelmäßige BSL2 erforderliche Hilfe zu einer funktionellen Einheit Motor in der Kulturschale zu reproduzieren. Diese Methode ist somit sowohl für den Muskelaufbau sowie die neuromuskuläre Forschungsgemeinschaften für physiologische und mechanistische Studien der neuromuskulären Funktion wertvoll, in einem normalen Rahmen und Krankheit.
Protocol
1. Vorbereitung des Primary Human Muscle Cell Culture
- Stellen Sie die menschliche Muskelkraft Zellkulturen gemäß der Explantation-Re-Explantation Technik 4. Entfernen Sie zunächst nicht Muskelgewebe aus den Biopsien. Dann betten 1 mm 3 Muskel Explantate in einem Koagulum von Plasma, das Fibroblasten aus den Explantaten entstehen können.
- Die eingebetteten Explantate werden auf einem Plasma-Gelatine beschichtete Schale überführt und lassen Sie sie in normalen Nährmedium wachsen (MEM mit 25% Medium 199, 10% fötalem Rinderserum [FBS], 1% Penicillin / Streptomycin, 10 pg / ml Insulin, ergänzt 10 ng / ml humanen epidermalen Wachstumsfaktor [EGF], 12,5 ng / ml menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor [FGF]) in einer Monoschicht. Die Zellen, die aus den Explantaten entstehen unter diesen Bedingungen sind Muskelzellen. Diese Zellen werden weiter in einer Monoschicht nach dem Entfernen der Explantate wachsen.
- Kultivieren der Zellen aneurally auf 0,1% Gelatine-beschichteten Platten in normalem Wachstumsmedium. Die Zellen könnenaneurally kultiviert und verstärkt nach Bedarf. Es ist besser, Muskelzellen mit einer Passage zwischen 3 und 8 verwenden, um die Co-Kulturen durchzuführen. Es ist wichtig, junge Myotuben innervieren; nach diesem Punkt haben die Co-Kulturen ein hohes Risiko des Scheiterns. Darüber hinaus sollte Myotuben nicht zu groß und zu dick.
- Zwei Tage vor der Innervation vorgesehen ist, die Platte Muskelzellen auf 35 mm-Gewebekulturschalen (oder 6-Well-Platten) in einer Dichte von 500.000 Zellen pro Schale in normalem Wachstumsmedium. Bei dieser Dichte sind die Zellen in der richtigen Konfluenz, um die Fusion am folgenden Tag zu beginnen, und anschließende Innervation am Tag nach. Mit Hilfe dieser Voraussetzungen sind die Myotuben zum richtigen Zeitpunkt für eine optimale Innervation und damit spätere Faser Kontraktion.
- Am nächsten Tag, ersetzen Sie den normalen Nährmedium mit einer Fusion Medium MEM komponierte mit 25% Medium 199, 5% FBS, 10 pg / ml Insulin und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt.
2. Isolati auf der Ratte Embryonale Spinal Cord Explantate
Das gesamte Verfahren, um die Wirbelsäule zu isolieren Explantate wird unter einem binokularen Mikroskop durchgeführt, in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS).
- Es ist entscheidend, dass die Ratte Embryonen sind zwischen ED 13 und 14 als eine andere Entwicklungsstufe würde das gesamte Verfahren zu gefährden. Opfere eine schwangere Frau mit CO 2 und das gesamte Embryo-Kette in HBSS Medium. Isolieren Sie jedes Embryo und enthaupten sie für Euthanasie.
- Präparieren Sie den Embryo Rückenmark vom Rest des Körpers in einem Stück zu entfernen und umliegenden Muskel-und Bindegewebe. Seien Sie sehr vorsichtig, um die hintere Wurzel Ganglien (DRGs), die an der Wirbelsäule, funktionelle Innervation gewährleisten zu halten.
- Schneiden jedes Rückenmark quer in einer Weise, dass jeder Explantat mindestens 2 DRG gebunden ist (Explantate von 1 mm 3).
- Entfernen Sie das Medium Fusion auf den Muskel-Zellkultur, so dass eine feine Schicht von Medium auf der Monoschicht.
- Legen Sie die Explantate vorsichtig auf die Muskelzelle Schicht, fünf gleichmäßig verteilte Explantate pro 35 mm Schale.
- In sehr langsam, tropfenweise, Fusion Medium auf jede Explantat. Es ist notwendig, Medium für den Muskelzellen hinzu, um zu überleben, aber nicht zu viel, damit die Explantate auf erste haften und Kontakt mit den Zellen. Wenn das Medium nicht richtig aufgenommen wird (zu stark oder zu viel Medium) werden die Explantate zu schweben und wird scheitern, die Muskelzellen zu innervieren.
- Sobald die Explantate zu haften beginnen, ganz oben auf der Fusion mittel-bis 2 ml pro 35 mm Schale, und stellte das Geschirr sehr sorgfältig zurück in den Inkubator.
4. Wartung der heterologen Nerv-Muskel-Co-Kulturen
- Ändern Sie die Fusion Medium zweimal pro Woche.
Sobald zwei Tage nach der Innervation, ist es möglich, die Neuriten, die aus jedem Explantat und der Herstellung von Kontakten mit den Muskelzellen, die von den Button-ähnliche Strukturen (Abb. 1) dargestellt zu sehen.
Bereits 4-6 Tage nach der Innervation, ein paar einzelne Fasern zur Kontraktion zu starten.
Die Wehen bestehen seit vielen Monaten, gewartet indem Sie einfach den Nährboden zweimal pro Woche.
Nach ca. 2 Wochen, degeneriert das Rückenmark Explantat selbst, sondern die Innervation konserviert ist. Das ist normal. Eine feine Schicht von Nervenzellen Komponente bleibt auf der Oberfläche der Muskelzelle Schicht. Diese Nervennetzwerk ausreichend ist, um die Funktionalität der Motoreinheit zu halten.
Wenn die Explantate im Medium der Tag nach der Innervation schweben, werden sie nie einhalten. Dies geschieht, wenn die Muskelzelle Schichtnicht ausreichend konfluent, oder wenn das Medium zu grob zugegeben. Manchmal werden die Explantat hält aber keine Neuriten hervor. Dies ist wahrscheinlich auf das Fehlen von DRG-ähnliches enthalten. In diesem Fall ebenso wird die Innervation nicht hergestellt werden. Manipulieren Sie das Geschirr sehr sorgfältig in der ersten Woche, als die Explantate noch leicht zu lösen. Um die Fusion Media tauschen, fügen Sie die Flüssigkeit tropfenweise mit einer minimalen Geschwindigkeit zu Zellablösung zu vermeiden.
Abbildung 1. Rückenmark Explantate-Muskelzelle Co-Kulturen von Tag 1 bis Tag 15.
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Discussion
Eine physiologische In-vitro-Werkzeug, um Muskel-Zell-Funktion in normalen und pathologischen Kontext zu studieren, ist von höchstem Interesse für die myologists, weil Muskel-Zellkulturen in der Regel nicht rekapitulieren die Bedeutung der mehrere Zellen und Zell-Typ-Verbindungen. Die Zugabe von gereinigtem motorischen Neuronen zu Muskelzellen ist nicht genug, um eine funktionelle Einheit Motors zu erreichen, da die Anwesenheit von Schwann-Zellen für die Innervation effizient zu sein 5 erforderlich ist, und es ist nicht topologisch (3D + Sonderausschüttung) relevante Das hier beschriebene Protokoll wurde soeben in den innervierten Muskelzellen in vitro und führt zu einer vollständigen Reifung NMJ, die leicht beurteilt werden kann, zu schaffen verwendet.
Murine Modelle sind jetzt für viele neuromuskulären Erkrankungen zur Verfügung. Leider sind viele dieser Modelle in Bezug auf die Übersetzung der Krankheit bei menschlichen Patienten beschränkt, zum Beispiel die Mausmodelle für spinale Muskelatrophie, DuchenneMuskeldystrophie oder amyotrophe Lateralsklerose. Spinale Muskelatrophie wird durch eine Mutation im SMN1-Gen, die zum Teil durch das Vorhandensein eines zweiten SMN-Gens im menschlichen Genom 6 abgemildert werden kann, verursacht. Im Gegensatz dazu enthält der Mäuse-Genom nur ein Gen für SMN, und deren Löschung ist embryonal letalen 7. So um die Maus spinale Muskelatrophie Modelle zu entwickeln, wurde ein Mensch SMN2 Kopie künstlich in das SMN-Knockout-Mäusen 8,9 eingeführt. Diese Tiere noch Betreiber der nächsten genetischen Modell der menschlichen Pathologie, sondern der Phänotyp bei diesen Mäusen beobachtet wurde, ist aufgrund der Expression eines Gens, das SMN2 Mäuse normalerweise nicht exprimieren 10. Bei der Duchenne-Muskeldystrophie, haben die mdx eine mutierte Dystrophin-Gen ähnlich dem menschlichen Patienten, aber das Ergebnis ist viel weniger streng Vergleich zu den Symptomen bei Patienten 11 beobachtet. Das am häufigsten verwendete Mausmodell für amyotrophic Lateralsklerose, die SOD1-Mäusen, so weit in aufschlussreiche Einsichten in Krankheitsmechanismen und therapeutische Ansätze 12,13 enttäuscht. Daher Rückenmark Explantate-Muskelzelle Co-Kulturen zur Untersuchung der Funktion, Genomik und Proteomik Eigenschaften des Muskels, die aus Patienten, in einem völlig physiologische Einstellung, stellen ein unschätzbares Werkzeug, um solche komplexen Erkrankungen zu studieren. Des Weiteren wird diese Hetero-Spezies-Modell hilft, zwischen neurogene und myogene pathologische Mechanismen zu unterscheiden. 3,14,15
Die Co-Kultur hier präsentierten auch einige Einschränkungen hat. Zum Beispiel sind Immunhistochemie Experimente über die Muskelzellen schwer auf dieser Struktur führen, da die Nerven Terminal von dem Explantat umfasst die postsynaptische ausgebildet NMJ Vorrichtung. Dieses System kann auch verwendet, um die neurotrophen oder myotone Auswirkungen von Drogen in einem integrierten und relativ reifen Kultur System zu beurteilen, aber es funktioniert nicht zulassen, dass High-Throughput-Screening, als das Volumen wäre viel zu groß. Interessanterweise, die homologe Nerven-Muskel-Co-Kultur mit sowohl der Nerv und Muskel kommenden Bauteile nur aus Maus oder Ratte ist nicht funktionsfähig und nicht in Muskelkontraktionen führen. Kürzlich jedoch hat homologen Innervation zwischen Maus Satelliten Muskelzellen und Rückenmark der Maus Explantate wurden erfolgreich durch Modifikation der Tag der Ernte Embryo (Callizot, Steinschneider und Kollegen, unveröffentlichte Ergebnisse) durchgeführt. Weitere Fortschritte bei der Schaffung Routineprotokollen für die homologe Co-Kulturen könnten helfen, den Arten Einschränkung, die für diese Technik gibt es heute zu überwinden.
Trotz dieser Einschränkungen, beschreiben wir hier eine Methode, die das Studium von vielen Aspekten des Muskel-und Motoneuronen Physiologie ermöglicht, eine Technik, die nicht ist schwierig durchzuführen, bedarf keiner besonderen Material besteht und dass führt zu stabilen Rückenmark Explantate Muskel-Co- Kulturen, die leicht aufrechterhalten werden können und Studiumd für viele Monate.
Bestimmte Aspekte des Protokolls sind von besonderer Bedeutung und brauchen besondere Pflege, um eine ordnungsgemäße Innervation zu gewährleisten. Zunächst müssen die Rattenembryonen zwischen 13 und 14 ED alt sein. Zweitens sichert 500.000 Zellen pro 35-mm-Schale die richtige Höhe der Zellkonfluenz, um die Einhaltung der Explantate, die zu den Muskelzellen aufgenommen werden sofort, wenn Zellfusion beginnt zu erleichtern. Schließlich, wie im Protokoll betont, ist die Zugabe des Mediums nach der Hinterlegung der Explantate auf die Muskelzellen der schwierigste Teil dieses Verfahrens und sollte mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Unsere Arbeit wird durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF), die Schweizer Initiative in Systembiologie (SystemsX.ch), der Gesellschaft für Muskelkranke USA (MDA), die Association Française contre les Myopathien (AFM), das Vereinigte Mitochondriopathie Stiftung unterstützt (UMDF), die Gebert-Rüf-Stiftung Seltene Erkrankungen Programm (GRF), der Schweizerischen Gesellschaft für Forschung der Muskelerkrankungen (SSEM / FSRMM), die Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und medizinische Forschung", der Roche Research Foundation und der Universität Basel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
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