Enkel og robust In vivo Og In vitro Approach for å studere Virus Assembly

Summary

En enkel, effektiv og robust måte å synkronisere levering av flere virale komponenter til planteceller via

Abstract

I virus med positiv-sense RNA genomet patogene for mennesker, dyr og planter, avkom encapsidation til modne og stabile virioner er en kardinal fase under etablering av infeksjon i en gitt host. Følgelig deciphers studie av encapsidation informasjon om know-how av mekanismen regulere viruset forsamlingen til å danne smittsomme virioner. Slik informasjon er viktig i utformingen av nye metoder for å dempe viruset spres og sykdomskontroll. Virus encapsidation kan studeres in vivo og in vitro. Genome encapsidation in vivo er en svært regulert selektiv prosess som involverer makromolekylær interaksjoner og subcellulære compartmentalization. Derfor studerer fører til dissekere hendelser som omfatter virus encapsidation in vivo ville gi grunnleggende kunnskap for å forstå hvordan virus sprer og montere. Nylig in vitro encapsidation har vært utnyttet til forskning på området i biomedisinsk imaGing og terapeutiske anvendelser. Ikke-kappekledde plante virus stå langt fremme i venture av in vitro encapsidation av negativt ladet utenlandsk materiale. Brome mosaic virus (BMV), en ikke-kappekledde multikomponente RNA virus patogene for planter, har vært brukt som en modell for å studere genomet emballasje in vivo og in vitro. For encapsidation analyser i Nicotiana benthamiana planter, Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk, kaller agroinfiltration, er en effektiv og robust teknikk for den synkroniserte levering og uttrykk av flere komponenter til samme celle. I denne tilnærmingen, er en suspensjon av Agrobacterium tumefaciens celler som frakter binære Plasmid vektorer bærer cDNAs av desiredviral mRNAs infiltrerte intercellular verdensrommet withina blad med noe mer sofistikert enn en 1 ml engangssprøyte (uten nål). Denne prosessen resulterer i overføring av DNA setter inn planteceller, T-DNASett forblir midlertidig i kjernen og blir deretter transkribert av verten polymerase II, som fører til forbigående uttrykk. Den resulterende mRNA transkripsjon (avkortet og polyadenylated) blir deretter eksportert til cytoplasma for oversettelse. Etter ca 24 til 48 timer inkubasjon, kan deler av infiltrert blader tas prøver for microscopyor biokjemiske analyser. Agroinfiltration tillater store tall (hundrevis til tusenvis) av celler som skal transfekterte samtidig. For in vitro encapsidation, rensede virioner av BMV er dissosiert til kapsid protein ved dialyzing mot dissosiasjon buffer som inneholder kalsiumklorid etterfulgt av fjerning av RNA og un-dissosiert virioner ved sentrifugering. Genomet utarmet kapsid protein subenheter er montert igjen med ønskede virusgenomet komponenter eller ikke-virale komponenter som indocyanine fargestoff.

Protocol

1. Plantemateriale

1. Nicotiana benthamiana planter som skal brukes i encapsidation analysen bør være på 4 blader stadiet (ca 3-4 ukers gamle planter).

2. Levering og uttrykk av funksjonelle virusgenomet komponenter til planteceller ved agroinfiltration

1. Dag 1: Agrobacterium stamme (eg. EH 105 eller GV 3101) harboring den pCass-BMV en RNA, BMV RNA 2 og BMV RNA 3 ^1,2 dyrkes på LB agar plater supplert med 50 mg / ml kanamycin (velger for den pCASS vektor) og 100mg/ml av rifampicin (velger for Agrobacterium). Inkubasjon blir utført ved 28 ° C i to dager.
2. Dag 3: vaksinere enkelt koloni fra LB agar plate inn i 2 ml LB buljong inneholder 50 mg / ml kanamycin og 100 mg / ml av rifampicin for en dag ved 28 ° C i orbital shaker satt til 250 RPM.
3. Dag 4: Inokuler 50 ml av LB kjøttkraft supplemented med 50 mg / ml kanamycin og 100 mg / ml av rifampicin, 10 mM MES pH 5,6 og 100 mm acetosyringone med en ml av kulturen i en 250 ml erlenmeyerkolbe i 16 timer ved 28 ° C på orbital shaker ved 250 RPM .
4. Dag 5: Overfør kultur (når OD ₆₀₀ nådde 1,0) til en Oak Ridge tube eller sterilt Falcon rør og sentrifuger i 10 minutter ved 5000 rpm ved 4 ° C.
5. Løs opp pellet i 10 ml 10 mM MgCl ₂ og sentrifuger i 10 minutter ved 5000 RPM ved 4 ° C, Gjenta dette trinnet en mer tid til å sikre fullstendig fjerning av antibiotika.
6. Heng pellet i 10 ml buffer som inneholder 10 mM MgCl ₂ og 10 mm MES (pH 5,6).
7. Mål OD ₆₀₀ for hver kultur av BMV en RNA, RNA 2 og RNA 3 og juster til 0,1 OD ₆₀₀ med 10 mM MgCl ₂ og 10mm MES (pH 5,6).
8. Bland 1 ml hver alle tre 0.1 _OD-600 kultur suspensjoner.
9. Tilsett 100 mm acetosyringone, mix gently og holde blandingen uforstyrret ved romtemperatur i 3 timer.
10. Tegn kulturen suspensjonen i 1 ml. sprøyte uten nål.
11. Infiltrere ovenfor kulturen suspensjonen i abaxial siden av 2-3 godt utvidede blader av N. benthamiana (5 blader stadium, 3-4 uke gamle planter) ved å trykke forsiktig på sprøyten til en halvdel av abaxial overflaten av blad.
12. Gjenta denne prosedyren infiltrasjon til andre blader.
13. Hold infiltrert planter i det grønne huset med 24 ° C.
14. Innhøstingen infiltrert blader 3 til 4 dager etter infiltrasjon (dpi).

3. Rensing av BMV virioner

1. Samle N. benthamiana etterlater agroinfiltrated med en blanding som inneholder alle tre villtype BMV agrotransformants.
2. Grind blader i en steril morter med lik volum (w / v) av BMV utvinning buffer (0,5 M NaAc; 0,08 M ​​MgAc, 4,5 pH og 1/100 volumet av β-mercaptoethanol som skal legges like før bruk) ^3. For å maksimere virus yield, er det anbefalt å legge syre vasket sand (~ 0,5 til 1 g) som gjør det enkelt sliping og effektiv celle avbrudd.
3. Filtrer blad ekstrakt gjennom 2-3 lag med musselin klut og samle Flurry.
4. Igjen slipe beholdt delen på musselin klut med lik volum av BMV utvinning buffer til den opprinnelige vekten av blad materiale.
5. Gjenta filtrering prosedyren ved hjelp musselin klut. Disse trinnene bør utføres ved 4 ° C.
6. Overfør filtratet løsning til en sentrifugerør og legge tilsvarende volum av pre-kjølt kloroform og virvle (eller rist) i 5 minutter ved romtemperatur til fargen på fjæringen blir lysegrønn.
7. Sentrifuger emulgert løsningen i 15 minutter ved 12 000 rpm ved 4 ° C.
8. Samle den vandige fasen og røre i 30 minutter på magnetrører å fjerne kloroform.
9. Overfør suspensjonen til en steril Ultrasentrifuger tube.
tre.
10. Sentrifuger ved 30000 rpm i 3 timer i en Beckman Ultrasentrifuger ved 4 ° C.
11. Kast supernatanten og suspendere pellet i ønsket volum av BMV suspensjon buffer (for å forberede suspensjon buffer fortynnet BMV utvinning buffer til 1/10 med sterilt destillert vann).
12. Den delvis renset virion forberedelse ovenfra trinn utsettes til 10-40% sukrose tettshetsgradient sentrifugering for 150 min på 28 000 rpm ved 4 ° C.
13. Samle viruset bandet enten manuelt eller ved en fractionator. Viruset Bandet vises blått under hvitt lys belysning.
14. Fortynn sukroseløsning inneholder virus prøve minst 50% med virus suspensjon buffer.
15. Sentrifuger utvannet virus inneholder sukrose løsning for 3 timer ved 30.000 rpm i en Beckman Ultrasentrifuger ved 4 ° C.
16. Endelig suspendere høyrenset viruset pellet i en ønsket volum av Viross suspensjon buffer.
17. Måle konsentrasjonen av virion (mg / ml) ved hjelp av spektrofotometer ved OD _260.

Merk: Basert på RNA innhold, er det utryddelse koeffisienten for BMV 5 ^4.

19. Kontroller renhet virioner ved å se etter TEM (Fig. A)

4. Utarbeidelse av kapsid protein subenheter for in vitro montering

1. Forbered en liter 1x virus dissosiasjon buffer (0,5 M CaCl _2, 50 mM Tris HCl, 7,5 pH, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT og 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Forbered dialysemembran ifølge Sambrook et al ^6.
3. Tilsett kreves konsentrasjon av renset virus inn i en dialyse bag.
4. Plasser viruset inneholder dialyse bag inn i et begerglass som inneholder 1x viruset dissosiasjon buffer.
5. Dialyser 24 timer ved 4 ° C while omrøring.
6. Samle løsning fra dialysen posen etter 24 timer og sentrifuger ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C. Dette vil skille BMV RNA fra dissosiert virioner.
7. Samle supernatanten og sentrifuger ved 35000 rpm i Beckman sentrifuger i 3 timer ved 4 ° C til pellet noen un-dissosiert virus partikkel.
8. Samle supernatanten.
9. På dette stadiet er det viktig å fjerne eventuelle forurensende virion RNA fra dissosiert kapsid protein subenheter. For å gjøre dette, bør supernatanten fra trinn 8 bli utsatt for en ny runde over natten remontering av kapsid protein subenheter uten å legge noe RNA (i RNA 1x montering buffer, se nedenfor) etterfulgt av en høy hastighet sentrifugering (30 000 rpm for 3 timer ved 4 ° C) til pellets eventuelle sammensatte virioner. Etter dette remontering trinnet, ville supernatanten holdige frakk protein subenheter være fri for gjenværende forurensende RNA. Men for å sikre dette, er det tilrådelig å utføre en ekstra i vitro montering med bare frakk protein subenheter ved hjelp av RNA 1x montering buffer. Etter over natten montering, må utarbeidelse være fri for sammensatte virioner (verifiser hjelp TEM).
10. Bestem konsentrasjonen av kapsid protein subenheter ved å måle på OD 254 og 280 nm eller av andre metoder som Bradford-analysen.
11. Utfør 12-15% SDS-PAGE etterfulgt av Western blot å bestemme integritet dissosiert kapsid protein subenheter.

5. In vitro montering av RNA inneholder virioner

1. Forbered RNA transkripsjoner å bli re-satt sammen til virioner og beregne konsentrasjonen ^7.
2. Bland kapsid protein subenheter og RNA transkripsjon i forholdet 1:05 (vekt / vekt) ^5.
3. Tilsett ovenfor blandingen til en dialyse bag og riktig sikre for å unngå lekkasjer.
4. Forbered 1000 ml. av RNA 1x montering buffer (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 7,2 pH, 10 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 1,0 mM DTT) ^5.
5. Plasser dialyse bag som inneholder reaksjonsblandingen mot 1x montering buffer i begerglasset og rør.
6. Dialyser re-forsamlingen reaksjon ved 4 ° C i 24 timer ved forsiktig omrøring.
7. Samle blandingen fra dialysen posen etter 24 timer og tilsett 1,5 ml av RNA montering buffer.
8. Passere denne blandingen gjennom en Centricon-100 kolonne ved sentrifugering på lav hastighet (2000 xg) i 30 minutter.
9. Vask kolonnen én gang med 1,5 ml montering buffer ved 4 ° C i 30 min.
10. Gjenta ovenstående vasketrinn to ganger.
11. Endelig Eluer re-montert virioner ved sentrifugering på 10 000 g ved 4 ° C i 5 min.
12. Anslå virion konsentrasjonen på OD-260 nm.

6. Fabrikasjon av optiske Viral Ghosts (OVGs)

1. Legg Indocyanine grønn (ICG) ⁸ til renset kapsid protein på ønsket konsentrasjon ratio (vekten forholdet mellom Indocyanine grønn og kapsid protein som brukes i denne rapporten var 1:10) en d blandes grundig ved pipettering.
2. Dialyser kapsid protein og ICG løsning mot OVG forsamlingen buffer (1 M NaCl, 50 mM NaAc; 1 mM EDTA, og 1 mm DTT, pH4.8) ved 4 ° C i 24 timer.
3. Etter 24 timer, samle løsning fra dialyse bag (12 kDa porestørrelse) og sentrifuger ved 90000 rpm i 1 time ved 4 ° C (Fig. B)
4. Fjern supernatanten og suspendere pellet i BMV suspensjon buffer ved virvling eller hvis den får suspendere seg selv i BMV suspensjon buffer natten ved 4 ° C.
5. Kontroller morfologi OVGs av TEM (Fig. C).
6. Mål absorbansen fra 240 nm til 950 nm med spektrofotometer (Cary 50, Varian Inc.), tilstedeværelse av ICG bekreftes ved underskrift absorbansavlesninger topper rundt 700 nm og 790 nm ^8. (Fig. D)
7. De typiske ICG fluorescens topper på ~~~HEAD=NNS 700 nm og ~ 800 nm kan sees på 620 nm eksitasjon av OVG løsning (Fig. D) med spektrofluorometer (3 Fluorolog, Jobin-Yvon).

_title "> 7. Representative Resultater

Figur A. TEM bilde av negativt fargede BMV virioner renset fra N. benthamiana planter agroinfiltrated med en blanding av alle tre villtype BMV agroconstructs (skala bar = 100 nm).

Figur B. Pellet av in vitro samlet ICG holdige OVGs etter høyhastighets sentrifugering.

Figur C. TEM bilde av negativt fargede ICG inneholder OVGs (skala bar = 100 nm).

Figur D. Absorbance (øverst) og fluorescens (nederst) spektra av OVGs. Eksitasjon bølgelengde brukes for OVG utslipp wsom 620 nm.

Discussion

Agroinfiltration tilnærming som presenteres her kan mye være knyttet til et bredt spekter av plante virus. Et kjennetegn trekk ved denne tilnærmingen er synkronisert levering av flere agroconstruct til samme celle-en stor ulempe vanligvis forbindes med rutinemessig brukes mekanisk inokulering av plante virus. In vivo og in vitro montering studier med brome mosaic virus som modell kan gjennomføres effektivt ved Følgende noen tips. (i) for vellykket infiltrasjon av N. benthamiana forlater ikke vanne plantene i 24 timer før infiltrasjon, (ii) Agrobacterium suspensjon kultur ville spre seg til intracellulære rom med letthet, om infiltrasjon ble utført mellom 4-5 PM, (iii) Den optiske tettheten av kulturen bør ikke overstige 1,0 ved OD _600. Infiltrasjon av agrocultures med høyere celle tetthet er kjent for å indusere celle toksisitet og blad senescence ^9,10 som kan alvorlig påvirke virusreplikasjon og påfølgende virionformasjon, (iv) Under infiltrasjon milde press bør brukes på abaxial siden av bladet for å unngå omfattende skader på bladet, som kan utløse immunrespons i plante; (v) Sukrose tettshetsgradient fra 10% til 40% kan gjøres i en tube med å lage 25% sukrose i BMV suspensjon buffer (ved å legge den høyeste konsentrasjonen og laveste konsentrasjon og dele det på to dvs. 10% + 40% / 2 = 25%) og umiddelbart fryse ved -80 ° C i 2 -4 hr og videre slik at sukrose å tine sakte ved å holde den over natten ved 4 ° C i en rett posisjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21