Summary
Hier zeigen wir den neu entwickelten I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung mit aufgetauten Sperma wurde konsequent in 5 Mausstämme mit dem Einsatz dieses Kits verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 genetisch veränderte Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später erfolgreich durch IVF gewonnen.
Abstract
Tausende von neuen gentechnisch veränderten (GV) Stämme von Mäusen haben seit dem Aufkommen der Transgenese und Knockout-Technologien geschaffen worden. Viele dieser wertvollen Tiere existieren nur als lebende Tiere, ohne Backup-Plan für den Notfall. Die Kryokonservierung von Embryonen können dieses Backup bieten, ist aber teuer, kann ein langwieriges Verfahren sein, und erfordert in der Regel eine große Anzahl von Tieren für den Erfolg. Seit der Entdeckung, dass Mausspermien erfolgreich mit einer grundlegenden kryoprotektive Agent (CPA), bestehend aus 18% Raffinose und 3% Magermilch kryokonserviert werden, hat Sperma Kryokonservierung zu einem akzeptablen und kostengünstiges Verfahren für die Archivierung, Verteilung und Rückgewinnung dieser wertvollen Stämme .
Hier zeigen wir ein neu entwickeltes I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Sperma aus fünf am häufigsten verwendeten Stämme von Inzucht-Mäusen wurden eingefroren mit diesem Kit und dann wiederhergestellt. Besserer Schutz-Verhältnisse von Spermien-Motilität (>60%) und schnellen progressiven Motilität (> 45%) im Vergleich zur Kontrollgruppe (unverwässert CPA) wurden für die Spermien mit diesem Kit in 5 Inzucht-Mausstämmen eingefroren gesehen. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung nach IVF mit dem Sperma gewonnen wurde konsequent in allen 5 untersuchten Mausstämme verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 GM Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später durch IVF gewonnen.
Protocol
1. Maus Spermien Kryokonservierung
- Für jede Zeile kryokonserviert werden, bereiten Sie die folgenden Punkte, bevor Anfang.
- 1 gut einer 4-Well Platte mit 240 l Kit CPA
- 15 Samen Kryokonservierung Strohhalme wie folgt
- Schließen Sie das 0,25 ml Pailletten, die 1 ml Spritzen mit dem Wattebausch am nächsten an der Spritze. In jedem Strohhalm, Last 8 cm (ca. 160 ul) IVF-Medium, dann 1 cm Luft. Beschriften Sie die Strohhalme mit den Namen der Linie erhalten bleiben.
- LN 2 sollte 15 cm tief in den Schaumstoff-Box werden. Schließen Sie den Deckel.
- Euthanize 2 männliche Mäuse aus jeder Zeile zu kryokonserviert werden. Mäuse sollten zwischen 10 und 60 Wochen alt sein. Entfernen Sie die beiden kaudalen Nebenhoden zusammen mit der Samenleiter von jeder Maus.
- Setzen Sie den Nebenhoden in die zuvor vorbereiteten CPA-haltigen Vertiefung einer 4-Well Schale (Schritt 1.1).
- Machen Sie 5-7 Längsschnitte in jedem Nebenhoden und sanftSqueeze jedem Samenleiter Spermien verdrängen.
- Schütteln Sie die CPA und Nebenhoden Mischung von Hand vorsichtig bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten. Damit können Spermien schwimmen.
- Mit dem zuvor vorbereiteten Stroh, absaugen 5 mm (ca. 10 ul) der Spermien Federung und dann 1 cm Luft.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit bis zu insgesamt 15 Strohhalme. Laden und Dichtung Strohhalme innerhalb von 10 Minuten für die besten Spermien überleben.
- Heißsiegel beiden Seiten des Stroh sorgfältig. Legen Sie die Strohhalme in den Gefrierpunkt Kanister mit dem Sperma Säule zuerst.
- Bringen Sie die 1 ml Pipette als Teil des Kits zu den Kanister mit dem Griff erstrecken. Setzen Sie den Kanister in LN 2 in der Schaum-Box durch das Loch in den Deckel. Lassen Sie den Kanister vertikal Schwimmer in der LN 2 für 10 Minuten.
- Tauchen Sie den Kanister in das LN2. Das Sperma wird nun kryokonserviert und können zu langfristigen LN 2-Speicherung verschoben werden.
- Der Behälter sollte nicht verwendet werden fürdie nächste Zeile, bis es sich auf Raumtemperatur erwärmt.
2. Maus Superovulation
- Im Allgemeinen benutzen jungen weiblichen Mäusen des gleichen Hintergrund wie der Samenspender.
- Mäuse sollten ~ 12 g (3-4 Wochen alt) werden.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit 5-10 IE Pregnant mare serum-Gonadotropin (PMSG).
- Warten Sie 46-48 Stunden.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit 5-10 IU humanes Chorion-Gonadotropin (hCG).
- Ernte-Oozyten 14-16 h nach hCG-Injektion, wie unten beschrieben.
3. Mausspermien Erholung und IVF
- Vor IVF, für jeden Strohhalm aufgetaut werden, bereiten die folgenden und für mindestens eine Stunde ins Gleichgewicht in einem 37 ° C CO 2-Inkubator.
- Sperm Inkubation Schüssel: eine 35 mm Petrischale mit einem 90 ul Tropfen Sperma Behandlung Medium (STM) mit Öl bedeckt.
- Cutting Gericht: Für Eizellenentnahme von maximal 10 superovulated Weibchen, einer 35 mm Petrischale mit 3 ml IVF Medium.
- IVF gut: Für jede Gruppe von 5 superovulierten Weibchen für IVF, eine Vertiefung einer 4 gut Schüssel mit 500 ul IVF Medium (wenn Sie mit 10 superovulierten Weibchen sind, zum Beispiel, Sie erhalten 2 Brunnen benötigen...)
- Washing Schüssel: eine 35 mm Petrischale mit 3 ml Kalium-simplex optimierten Medium (KSOM) zum Waschen jeder Vertiefung der 4-und IVF Gericht verwendet
- Kulturschale: eine 35 mm Petrischale mit 50 ul Tropfen KSOM Medium mit Öl für die Embryo-Kultur aus jedem Well der IVF Schüssel abgedeckt.
- Nehmen Sie einen Strohhalm aus LN 2 und in einem 37 ° C Wasserbad für 2-3 Minuten.
- Entfernen Sie das Stroh aus dem Wasserbad und wischen, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Machen Sie den ersten Schnitt in der Nähe der ersten Luftsäule nächst der Wattebausch. Schneiden Sie das Stroh in der IVF-Medium gibt es noch eine Luftsäule sichtbar, bevor die Spermien Spalte werden.
- Dann schneiden Sie das Ende des Strohs in den sZWEITEN Luftsäule, wobei darauf zu vermeiden, schneiden die Spermien Spalte. Cut bei einem 45 ° Winkel - das macht es viel einfacher, das Sperma absaugen.
- Saugen Sie die Spermien Suspension aus dem distalen Ende des Strohs mit einer 200 ul Pipette.
- Legen Sie die Spermien Suspension in der Mitte des STM Drop und inkubieren Sie die Schale für 45-60 Minuten in einem 37 ° C 5% CO 2-Inkubator.
- Während die Spermien Inkubation sezieren die Eileiter der superovulierten Weibchen in die Schneiden Gericht. Verwenden Sie eine 30 g Nadel oder Pinzette zu jedem Eileiter reißen, die Freigabe der Kumulus-Eizell Komplexe (KOK). Vermeiden Sie Fett und Blut in der IVF-Medium wie verschmutzte Medien für zusätzliche Waschschritte macht.
- Nachdem alle die Eileiter wurden abgerissen, übertragen Sie die KOK von 5 Hündinnen zu jedem IVF Brunnen. Die Zahl der KOK durch Superovulation produziert ist sehr belasten abhängig.
- Sammeln 10-15 ul von Spermien aus der Peripherie des STM Drop und befruchten IVF und etwa 14-16 Stunden post hCG injection. Wiederholen Sie die Befruchtung für jeden gut genutzt. Finale Spermienkonzentration werden ca. 1 Mio. / ml sein.
- Cokultur Spermien und Eizellen für 4-6 Stunden in einem 37 ° C 5% CO 2-Inkubator.
- Waschen Sie die Embryonen mit KSOM mindestens 2 Mal und Kultur in KSOM Tropfen für die Entwicklung in einem 37 ° C 5% CO 2-Inkubator.
- IVF-Rate wurde in zwei Zell-Embryonen aus insgesamt Eizellen nach Übernacht-Kultur verwendet berechnet.
4. Repräsentative Ergebnisse
Sperma von 5 Charles River Maus Inzuchtstämme wurde eingefroren. Schutz Verhältnisse sind, indem gefrorenen Sperma Beurteilung Werte von frischem Sperma Bewertung berechnet. Schutz-Verhältnisse von Spermien-Motilität wurden 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% für C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl und BALB / cAnNCrl jeweils. Schutz-Verhältnisse für schnellen progressiven Motilität wurden 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl und BALB / cAnNCrl bzw. (Abb. 1).
Die IVF Raten mit aufgetauten Spermien wurden 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% und 26,2% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl und BALB / cAnNCrl bzw. (Abb. 2) .
Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 GM Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung archiviert. Diese Linien wurden später erfolgreich wiederhergestellt (wie Live-Welpen geboren definiert) durch IVF in 4 weiblichen Stämmen (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 und 129Sv) (Abb. 3).
Abbildung 1. Der Schutz Ratios von Spermien-Motilität und schnellen progressiven Motilität in Mäuse
Abbildung 2. In-Vitro-Fertilisation mit aufgetauten Sperma in Mäuse
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Abbildung 3. In-vitro-Fertilisation mit aufgetauten Sperma in GM Mäuse
Discussion
Seit 1990 ist die grundlegende Sperma Einfrieren Protokoll mit 18% Raffinose und 3% Magermilch erwiesen in viele Stämme von Mäusen zuverlässig und eine große Anzahl von Mauslinien wurden 1,2,3,4,5,6,7 kryokonserviert. Die wichtigsten Ursachen für Schäden an Spermien während der Frost-Tau-Prozess haben mit Eisbildung 8,9 und reaktiven Sauerstoff-Spezies 10 in Verbindung gebracht. Supplementierung mit Radikalfängern, wie Aminosäuren und Reduktionsmittel, wie z. B. Monothioglycerol, in dem Einfriermedium wurde untersucht und bewiesen deutlich zu erhöhen IVF-Rate mit aufgetauten Samenzellen in Inzuchtstämme einschließlich der C57BL / 6 11,6.
Im vorliegenden Protokoll, entwickelten wir einen neuen I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung durch die Optimierung der grundlegenden CPA mit handelsüblichen Antioxidantien und Eis-Blocker und durch Veränderung der Spermien Einfrieren und IVF-Verfahren. Schutz-Verhältnisse von Spermien-Motilität(> 60%) und schnellen progressiven Motilität (> 45%) wurden für die Spermien von fünf Inzucht-Mausstämmen mit dem I • Cryo-Kit eingefroren gesehen. Die 2-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung Rate mit aufgetauten Samenzellen in 5 Maus Inzuchtstämme war deutlich im Vergleich zu dem mit den grundlegenden CPA 11,6 verbessert.
In Verwendung des Kits erstellt der Benutzer eine konzentrierte Sperma Suspension durch das Einfrieren von Spermien 2 Rüden für jede Zeile. Mit nur Einfrieren 15 Strohhalme der Prozess ist schnell, einfach und belegt weniger Speicherplatz für kurze oder langfristige Lagerung. Die meiste Zeit kann Mauslinien durch Auftauen nur 1 oder 2 Strohhalme wiederhergestellt werden.
Disclosures
Die Autoren sind Mitarbeiter von Charles River, der Hersteller des Kits.
Acknowledgments
Die Forschung hier vorgestellte wurde von Charles River unterstützt. Die Autoren sind sehr dankbar, dass der gentechnisch veränderte Models and Services-Gruppe und der Embryologie Mitarbeiter für die Tierpflege und Hormon-Einspritzung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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