We presenteren een methode om een beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vivo beeldvorming van corticale functie vereist optische toegang tot de hersenen, zonder verstoring van de intracraniële omgeving. We presenteren een methode om een gepolijste en versterkte verdund schedel (poorten) venster te vormen in de muis schedel die enkele millimeters in diameter overspant en is stabiel voor maanden. De schedel verdund 10 tot 15 urn dik een draagbare boor optische helderheid bereiken en vervolgens bedekt met cyanoacrylaatlijm en een dekglas: 1) voorzien stijfheid, 2) remmen been hergroei en 3) te verminderen lichtverstrooiing onregelmatigheden op het botoppervlak. Omdat de schedel niet wordt doorbroken, is een ontsteking die het proces wordt bestudeerd van invloed kunnen zijn sterk verminderd. Imaging tot een diepte van 250 pm onder de corticale oppervlak kan worden bereikt met behulp van twee-foton laser scanning microscopie. Dit venster is zeer geschikt voor cerebrale doorbloeding en cellulaire functie te bestuderen in zowel onder narcose en wakker preparaten. Het biedt verder de opprima gelegenheid om cel-activiteit met behulp van optogenetics te manipuleren of de bloedstroom in gericht schepen verstoren door bestraling van circulerende fotosensitizers.
Protocol
1. Voorbereiding voor Chirurgie i
- Maak de chirurgische instrumenten door sonicatie in een mengsel van Maxizyme en Chirurgische Melk in een ultrasone reiniger. Autoclaaf de chirurgische instrumenten voor elk experiment.
- Zorg ervoor dat alle benodigde reagentia en disposables beschikbaar zijn. Een lijst van reagentia en disposables wordt gegeven in tabel 2. Reagentia en disposables die in contact komen met zichtbare weefsel moet steriel zijn, indien mogelijk.
- Laten verdoving. Typische anesthetica voor overleving studies worden in Tabel 1. Zorg voor chirurgische vlak van anesthesie door te controleren op het ontbreken van teen k....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Twee-foton imaging door een ports raam vereist transmissie via de verdunde bot en de duur, dat het laserlicht verzwakt en voegt optische aberraties op grotere diepte 8. Ondanks dit nadeel kan beeldvorming diepte van 250 pm onder het oppervlak pial worden bereikt met 900 nm excitatie. Grotere diepten beeldvorming kan in principe mogelijk meer excitatiegolflengten 13. Een groot voordeel van deze methode is de afwezigheid van corticale ontsteking die tijdelijk zou kunnen bestaan in methoden met voll.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (Post-doctorale beurs te Ays) en de National Institutes of Health (MH085499, EB003832 en OD006831 naar DK). Wij danken Beth Friedman en Pablo Blinder voor commentaar op het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Agent | Route van levering | Dosis voor muis | Duur | Opmerkingen | Bron | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 mg / g | 15-60 min | Smalle veiligheidsmarge. Werk om de juiste dosering van de anesthesie langzaam. Supplement 10% van de inductie-dosis nodig is. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) gemengd met xylazine (Anased) | IP | 60 pg / g (K) 10 pg / g (X) (mengsel in dezelfde injectiespuit) | 20-30 min | Xylazine wordt mede geïnjecteerd als een spierverslapper en pijnstiller. Toeslag alleen Ketamine op 50% van inductiedosis zoals vereist. | (K) 010177, (X) 033.198; Butler Schein | 7 |
| Isofluraan (Isothesia) | Inademing | 4% betekenen alveolaire concentratie (MAC) voor de inleiding; 1-2% MAC voor onderhoud | 4-6 uur. | Geldt mengsel van 70% zuurstof en 30% lachgas. Langdurige anesthesie leidt tot langzamer herstel. | 029403; Butler Schein | 26 |
Tabel 1. Anesthetica aanbevolen om te overleven studies.
| ITEM | BEDRIJF | catalogus # / MODEL |
|---|---|---|
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorfine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluoresceïne isothiocyanaat dextran, 2 MDa molecuulgewicht | Sigma | FD2000S |
| Isopropylalcohol | Visser | AC42383-0010 |
| Ringer-lactaat oplossing | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine oplossing, 2% (v / v) | Butler Schein | 002468 |
| Zoutoplossing | Butler Schein | 009861 |
| Chirurgische Milk | Butler Schein | 014.325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa moleculair gewicht | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide bramen, 1/2 mm formaat tip | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Dekglas, nee. 0 dikte | Thomas Wetenschappelijk | 6661B40 |
| Cyanoacrylaatlijm | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas stofdoek | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cementpoeder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement oplosmiddel | Dentsply | 675572 |
| Insuline spuit, 0,3 ml volume met 29,5 naald | Butler Schein | 018384 |
| Moer en bout aan het hoofd vast | Digikey | Nut, H723-ND, bout, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic zalf | Butler Schein | 039886 |
| Scalpelmesjes | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Schroeven, zelftappende # 000 | JI Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium kit | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide poeder | Mama's Mineralen | EQT-TINOX |
| UITRUSTING | ||
| Glas schrijver | Fisher Scientific | 08-675 |
| Het ontleden van microscoop | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Elektrisch aangedreven boor | Foredom of Osada | K.1020 (Foredom) of EXL-M40 (Osada) |
| Elektrisch scheerapparaat | Wahl | Series 8900 |
| Tang, Dumont nee. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Terugkoppeling gereguleerde warmte pad | FHC | 40-90-8 (rectaal thermistor, 40-90-5D-02; heet pad, 40-90-2-07) |
| Isofluraan vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulsoximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Schroevendraaier, miniatuur | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxisch frame | Kopf Instrumenten | Model 900 (met de muis anesthesie masker en niet-ruptuur oor bar) |
| Chirurgische schaar, stompe einde | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasone reiniger | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Tabel 2. Lijst van specifieke reagentia, disposables en apparatuur.
Referenties
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex re....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
