Utarbeidelse av en våken Mouse for opptak Neural Responses og injisere Sporingsstoffer

Summary

Elektrofysiologisk karakterisering av nevrale responser er viktig for å forstå hjernens funksjon og for guiding plassering av fargestoffer for veien tracing. Men mange studier utført i anesteserte dyr. For å forstå hjernens funksjon uten bedøvelse, har vi utviklet en metode for å registrere nerveaktivitet egenskaper og injisere fargestoffer i våken mus.

Abstract

Det er velkjent at anestesi endrer nevrale respons egenskaper i ulike regioner av hjernen. ^13. I det auditive systemet, er fundamentale respons egenskapene til hjernestammen nevroner inkludert terskel, frekvens spesifisitet, og hemmende sidebands endret på vesentlige måter under narkose ^1-2. Disse observasjonene bedt fysiologer å finne måter å ta opp fra én nevronene uten forurensende effekten av anestesi. Et resultat var en decerebrate forberedelse, der hjernestammen ble fullstendig transected på nivået av midbrain ^4. Ulempene med dette preparatet er en formidabel kirurgi, eliminering av synkende anslag fra forebrain, og en manglende evne til å bruke sansestimulering for å undersøke strukturer over midbrain. En annen strategi har vært å implantere elektroder matriser kronisk å ta opp fra én nevroner og multiunit klynger mens dyret er våken og / eller oppfører seg ^5,6 7-9 til mus ^10-12. Ved hjelp av denne metoden, er vi i stand til å gjennomføre elektrofysiologiske opptak over flere dager i unanesthetized mus. På slutten av innspillingen, kan vi da injisere et fargestoff for å rekonstruere elektrode stillinger og opptak nettsteder eller injisere sporstoff slik at veier til og fra innspillingen loci kan bestemmes. Denne metoden gjør det mulig for godt isolert enkelt neuron opptak over flere dager uten bruk bedøvelse.

Protocol

1. Head-beherskelse Oversikt

1. For å montere en spesialbygd head-post, sette inn en 1/16 "rustfritt stål roll-pin vinkelrett inn i et hull boret i en 3/32" rustfritt stål stang for å danne et kors. Den vertikale del av hodet-post skal være ca 20 mm og den horisontale korset stykke om 15 mm. Trykk den ene enden av den vertikale stangen til å akseptere en # 1-72 skrue. (Fig. 1).
2. Under kirurgi og opptak, er head-post sikret i en spesialbygd messing eller aluminium montering bar med en # 1-72 skrue (Fig. 2). Den lange stykke av montering baren bør være ca 90 mm lang og 5-10 mm bred. Hodet-post passer inn i et spor skåret i en 15 mm forlengelse av den lange baren som er vinklet i 45 grader. For å hindre rotasjon, tverrstykket av hode-post nestles inn i et lite spor på bunnen av montering bar.
3. Monteringen bar i så festet til en spesiallaget aluminium montering blokkk (Fig. 3). Monteringen blokken er ca 30 mm x 30 mm x 25 mm. Dette montering blokken er festet til en micromanipulator slik at plasseringen av head-post kan være nøyaktig plassert langs midtlinjen og på Bregma. Monteringen blokken er laget av to stykker satt sammen med skruer. En utsparing i blokken tillater montering baren å gli inn og sikres med skruene. Monteringen Baren er parallell til bordet overflaten. Under opptak sikre baren i en egendefinert stereotaxic ramme (Fig. 4). Den stereotax er laget for å montere baren i samme posisjon som i montering blokken under operasjonen. Denne ordningen sikrer at musen alltid vil bli justert til stereotaxic rammen over eksperimentelle økter.
4. Skjær en wolfram stang (diameter 0.010 ") til ca 5 mm lengde, med ca 1 mm bøyd i 45 °. Denne stangen fungerer som bakken pin (Fig. 1).

2. Stereotaxic Alignment for kraniotomi

Merk: Alle prosedyrer beskrevet nedenfor følger standard aseptiske kirurgiske teknikker og har blitt godkjent av Washington State University Animal Care og bruk komité og Animal Ethics Committee av Garvan Institute.

1. Anesthetize musen ved å plassere i en induksjon kammer med 5% isofluran. Mangelen på en reaksjon på halen og / eller tå knipe sikrer at dyret er helt bedøvet.
2. Plasser musen i en gnager stereotaxic ramme utstyrt med en mus adapter (Stoelting). For å orientere musen korrekt, plasserer tennene inni hullet på bittet baren og stram nesen klemmen slik at den sitter stramt. Plasser musen så rett som mulig i bittet baren og nese klemme. Plasser en ansiktsmaske laget av et stykke lateks hanske over musens nese, og holde isofluran på 5% til musens respirasjon er ca 1 pust / sek. Snu isofluran 1,5 - 2,0%. Fest hodet ved than øre-barer er forsiktig med å ikke punktere trommehinnen. Barer skal være ettersittende, men ikke trenge for dypt inn i øregangene.
3. Plasser en varmepute under musen.
4. Påfør ophthalmic salve for å hindre at øynene tørker ut.
5. Shave hodebunnen fra mellom ørene opp for øynene med en liten barbermaskin eller fin-punkts saks.
6. Rengjør og steriliser hodebunnen ved å tørke med klor-hexidine (eller Betadine) skrubb etterfulgt av alkohol skylling gjentas 3 ganger.
7. For å fjerne huden over toppen av skallen gjøre et snitt langs midtlinjen fra baksiden av hodet til øynene.
8. Skrap det periosteum til kantene på snittet med en skalpell. Hvis nødvendig (avhengig av eksperimentell mål), forsiktig trekke muskulaturen på baksiden av halsen med tang, slik at muskelen til å rive langs fascicles å minimere blødning. Påfør gelfoam under hodebunnen vev for å minimere fukt og hindre huden i å bevege seg over skallen.
9. Tørk skallen overflaten med en bomull-tipped applikator fuktet med isopropylalkohol for å forbedre visualiseringen av skallen landemerker.
10. Juster skallen til standard stereotaxic koordinater ^13. Sett en fin-punkt sonde i elektroden holderen og fest den til stereotaxic micromanipulator. En skjerpet metall stang fungerer bra til dette formålet (Fig. 5).
11. Bruk poenget å identifisere Bregma (Fig. 5A) og Lambda (Fig. 5B) på skallen. Flytt sonden frem-og-tilbake mellom disse punktene, sjekke at den laterale-mediale koordinaten for hvert sted skiller ikke mer enn 50 mikrometer. Plasser hodet som trengs av forsiktig løsne øre-barer, skiftende hodet og øre-barer sidelengs, og trukket til øre-barer.
12. Kontroller at dorsal-ventral høyde på hvert sted skiller ikke mer enn 50 mikrometer. Juster høyden på nese-klemmen, som skal rotere hodeskallen rundt aksen av øre-barer,å utjevne banen av skallen om nødvendig. Høyden på øre-baren kanskje også må justeres.
13. Bruk et atlas ¹³ for å identifisere koordinatene til målet av interesse (Fig. 5C) i forhold til Bregma. Marker skallen over målet (for eksempel en "X" eller bruke tusj for å dot fire hjørnene av et kvadrat) hvor en kraniotomi vil bli gjort (Fig. 5D).

3. Hode-post og Ground Pin Installasjon

1. Bruk etch gel å rengjøre skallen. Bruk applikatoren til å skrubbe og spre etch gel over overflaten (10 sek). Vask med vann og tørke helt. Påfør primer for dental sement til skallen overflaten ved hjelp av applikator. Spre limet med ny applikator. Kurere limet med en UV lys-gun (1 syklus).
2. Velg en plassering for bakken pin som er distalt for målområde. Nøye bar et lite hull i skallen med tuppen av en # 65 miniblade skalpell akkurat bred nok for den korte enden av bakken pi å gå inn og hvile på hjernehinnene. Bakken pin bør orienteres slik at det peker bort fra Bregma og fremtiden hode-post (Fig. 6A).
3. Fest hodet-post til montering bar og blokkere og fest til micromanipulator. Ved å flytte micromanipulator i tre dimensjoner, plasserer hodet-post i løpet Bregma, bare berøre skallen (Fig. 6B). Basen i hode-post skal ligge flatt på skallen.
4. Ved hjelp av disseksjon sonder, påfør en liten mengde av dental sement rundt hodet-post og jord pin (Fig. 6C). Trykk på sement ned for å sikre god kontakt med skallen. Merk: Ikke bruk for mye sement eller det vil ikke stivne jevnt. Kurere sement med en UV lys-gun (3-4 sykluser fra flere vinkler).
5. Bruk den andre fasen av sement og bygge opp basen rundt hodet-post og dekker sporene i head-post (Fig. 6D).

4. Kraniotomi

1. Finn kraniotomi referanse merket, som vil bli delvis skjult av primer. Bruk en # 65 skalpell for å markere en 3 mm x 3 mm firkant rundt dette området og påfør en dråpe lidokain å redusere følsomheten og å minimere blødning.
2. Lag flere scorer på hver side av torget (så mange som 10), være forsiktig med å skjære gjennom bein og inn i hjernen (Fig. 7A).
3. Når benet klaff blir løs, bruk tuppen av skalpell for å lirke den opp, forlater dura mater intakt (Fig. 7B).
4. Dekk med bein voks.

5. Post-kirurgi

1. Slå av gass anestesi og fjerne musen fra stereotaxic rammen.
2. Bruk en bomull-tipped applikator å søke Lidokain salve rundt eksponert hud å døyve følelsen rundt såret. Bruk en annen bomull-tipped applikator for å søke Neosporin til eksponert hud. Injiser ketoprofen (5 mg / kg IM eller IP basert på preferanse for individuelle IACUC veterinærer) somen post-kirurgi smertestillende. Mus vil vanligvis være opp og flytte i løpet av minutter av gass opphør.
3. Plasser musen i en varm bur og skjermen inntil den er klar til å returnere til dyr bolig.
4. Dyret bør kontrolleres minst en gang per dag etter at den har kommet fra kirurgi. Se etter tegn på dårlig kosthold og / eller drikke og giddeløs oppførsel. Hvis smerte er mistenkt, gi ketoprofen hver 24. time (samme dose som ved utgangen av post-kirurgi) inntil lindres. Lidokain kan lokalt brukes på såret hvis dyret skrape eller viser tegn til ubehag. Dyr typisk komme fra kirurgi uten komplikasjoner eller smerte.

6. Opptak og Dye innsprøyting

1. Vent minst en dag etter hode-post kirurgi før du bruker musen for opptak.
2. Plasser musen i en skum-holdeanordning støpt til musens kroppen. Musen har allerede blitt tilpasset denne enheten, og dermed redusere sin angst. Typisk tilpasning erå håndtere musa hver dag etter avvenning og for omtrent en uke før operasjonen og eksperimenter, plassere musen i skum enheten for 1-5 minutter. Heng enheten i stereotaxic rammen (Fig. 4).
3. Sikker hode-post til montering bar, som nå festet til stereotaxic rammen (Fig. 4).
4. Koble til bakken pin med en ledning avsluttet med en stump 22-gauge kanyle tips.
5. Fjern ben voks over kraniotomi. Fjern dura om nødvendig med spissen av en miniblade skalpell.
6. Kjør elektroden til riktig stereotaxic sted og begynne innspilling (Fig. 8). For bare elektrofysiologiske opptak, kan en rekke elektroder brukes. Valget av elektroden er avhengig av beliggenhet og type opptak kreves. Valg av elektrode for våken mus opptakene vil være den samme som hva en forsker bruker i en bedøvet mus. For kombinerte elektrofysiologiske opptak medfargestoff / tracer injeksjoner, er en mikropipette elektrode brukt ^10. Den mikropipette er fylt med fargestoff / tracer av valget, slik at den kan iontophoretically injiseres i slutten av elektrofysiologiske eksperimenter. Multibarrel elektroder kan også brukes slik at farmakologiske manipulasjoner kan gjøres. Den multibarrel elektroden er montert på en enkelt innspilling mikropipette (Fig. 8). Disse teknikkene er standard i litteraturen og er ikke annerledes for anesteserte versus våken innspillinger.
7. Opptak kan gjøres for 4-5 timer over 3-4 påfølgende dager.
8. På slutten av innspillingen, kan fargestoffet / sporstoffet injiseres. Fordi det er ingen smerte reseptorer i hjernen, er den iontophoretic injeksjon av fargestoff eller tracer inn i hjernen sannsynligvis ikke gi ubehag. Men når de elektrofysiologiske responsen egenskapene for regionen der injeksjonen skal gjøres er preget, kan dyret være bedøvet med isofluran feller injeksjon. Dette vil eliminere eventuelle uønskede opplevelser. Fordi fargestoff / tracer er allerede i mikropipette, kan de aktive og jordledninger kobles fra elektrofysiologisk innspillingen oppsettet til gjeldende generator til iontophoretically injisere fargestoff / tracer. Bruk egnet protokoll for fargestoff / tracer i elektroden. Fjern dyret fra headpost tilbakeholdenhet og kropp tilbakeholdenhet og returnere til sitt hjem bur.
9. På slutten av forsøket, følg passende protokoll for eutanasi og vev behandling for å gjenopprette injeksjonsstedet og merking.

7. Representative Resultater

Vellykket installasjon av head-post gjør at eksperimentator å registrere single og multiunit svar fra en unanesthetized, våken musen over flere dager. Den tilbakeholdenhet Systemet tillater stabile elektrofysiologiske opptak av single nevroner i hjernen. Utmerket isolasjon av enkeltstående enheter og sterke reaksjoner to stimuli kan registreres fra samme hjernens struktur over flere dager, for eksempel i mus underlegne colliculus (Fig. 9A, dag én, figur 9B, dag to). Med en god hode-post installasjon, vil hver mus være konsekvent justert til stereotaxic apparat og musen stereotaxic atlas, ¹³ resulterer i pålitelig lokalisering av særlig hjernen kjerner. Denne pålitelige lokalisering gir for injeksjon av fargestoffer og sporingsstoffenes inn i bestemte strukturer etter flere opptak dager. For eksempel, for å vurdere synkende anslag fra den auditive midbrain til auditive hjernestammen, biotinylated dekstran amin (visualisert ved hjelp diaminobenzidine som chromagen) kan injiseres i mus mindreverdig colliculus (Fig. 10A) etter elektrofysiologisk identifisere nerveaktivitet egenskaper på injeksjonsstedet (i fig. 10A ble en nervecelle spilt med en best frekvens på 51 kHz), og etter vev behandling, ennterograde merking i kontralaterale dorsal cochlear kjernen kan blitt visualisert og plottet (Fig. 10B). Photomicrographs ved høyere oppløsning kan også fås til å vise anterogradely merket axoner og terminaler (Fig. 10C).

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

Figur 5.

Figur 7.

Figur 8.

Figur 9.

Figur 10.

Discussion

Fordelen med head-post fengsling system for elektrofysiologiske og nevroanatomi eksperimenter i mus er at eksperimenter kan utføres med unanesthetized, våken mus, eliminere potensiell respons forurensning på grunn av anestesimidler. I tillegg satt opp kan brukes over flere dager for å tillate mer effektiv dyr bruk.

De fleste komponenter for hode-post er tilgjengelig off-the-sokkel. Bare hodet-post og montering apparater er skreddersydd, som begge er relativt enkelt å konstruere og er gjenbrukbare. Hvis en maskin butikk ikke er tilgjengelig ved en institusjon, kan forskeren sannsynligvis bruke http://www.emachineshop.com/ å dikte de nødvendige komponentene.

Dyktige kirurgiske ferdigheter er nødvendig. Kirurger må være dyktig med fine kirurgiske teknikker, hvorav noen er best gjøres under et mikroskop. Det kirurgi må gjøres under aseptiske forhold. Fjerne skallen klaffen er det mest delikate punktet i prosedyren. Ved nøye og forsiktig lage flere score med en skalpell langs de 4 sidene av rektangelet mens du ser gjennom et driftsresultat mikroskop, kan skallen klaffen bli "poppet ut" med minimal blødning, forlater dura mater intakt. Kjennskap til den underliggende blodkar er avgjørende, som gjør et kutt over en stor blodåre skaper en risiko for uønsket blødning. Fordi vår forskning fokuserer på det auditive system, har vi unngått bruk av øvelser for å utføre craniotomies for å minimalisere potensialet for bein-gjennomførte indre øret traumer.

Det er viktig å få anterior-posterior fly nivå og i stereotaxic innretting før du fester hode-post. Denne forholdsregelen sikrer at hodet vil forbli nivå over eksperimentelle forsøk og forenkler plasseringen av hjernen loci ved hjelp av en hjerne atlas.

telt "> For opptak, er det nyttig å håndtere musa på en daglig basis for et par dager før operasjonen. Bare få musen utsatt for håndtering og tilbakeholdenhet i skummet enheten forenkler lengre innspillinger med mye redusert stress og bevegelse av mus. Nøkkelen er å ha musen passer godt i skummet sandwich. Hvis dyret kan bevege overdrevet, pleier det å kjempe kontinuerlig. Hvis musen begynner å slite, er det best å avslutte innspillingen og plukke opp igjen neste dag. Bevegelse av mus resulterer i store biopotentials i opptakene som ikke evoked av stimuli. Disse er vanligvis større amplitude som aksjonspotensialer og er midlertidige. Movement artefakter kan også genereres med registrering ledninger berøre dyret. Det er viktig å sikre at det ikke er noen ledninger berøre dyret. Samlet har denne teknikken tillot oss å gjennomføre flere undersøkelser på auditiv prosessering og anatomi uten bruk av bedøvelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP