Summary
इस अनुच्छेद में, हम assays में थर्मल nociception अध्ययन को दिखाना है
Protocol
दो यह थर्मल nociception assays के लिए सामान्य या यूवी अवगत लार्वा तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक कदम की एक विशिष्ट रूपरेखा चित्र 1 में दिखाया जाता है.
1. लार्वा की तैयारी
- पुरुष और महिला एक वांछित जीनोटाइप की संतान लार्वा सीधे परीक्षण किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक आनुवंशिक पार से स्थापित किया जा सकता है ब्याज की एक परिभाषित जीनोटाइप की संतान लार्वा प्राप्त है. मक्खी 20-30 कुंवारी महिलाओं और 15-20 पुरुषों का उपयोग भोजन युक्त बोतल में सेट पार.
- 5 दिनों के बाद अण्डा देना, फसल और स्वच्छ जल्दी बाहर scooping भावुक मक्खी भोजन और धीरे से 630 माइक्रोन (ताकना आकार) जाल के माध्यम से पानी के साथ चल रहे तनाव ने तीसरे instar लार्वा. भोजन के एक छोटे से नम पैड भुखमरी और dessication को रोकने के लिए स्थानांतरण जल्दी तीसरे instar लार्वा (~ अग्रपश्चस्थ अक्ष के साथ लंबाई में 3-4 मिमी). यदि nociceptive संवेदीकरण के लिए परीक्षण किया जा रहा है, बाद में 2.1 2.11 चरणों का पालन करें. यदि लार्वा के लिए कर रहे हैं absenc में परीक्षणऊतकों को नुकसान के ई, सीधे से 3.1 कदम आगे बढ़ना.
2. ईथरीकरण और यूवी किरणन
- ईथरीकरण कक्ष का निर्माण.
- 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब बंद नीचे कट.
- एक गर्म धातु रंग के साथ microcentrifuge ट्यूब की कटौती बढ़त पिघला.
- प्रत्यय पिघल ट्यूब की सतह के लिए एक ठीक जाल और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. ईथरीकरण कक्ष ईथर धुएं के प्रवेश की अनुमति देने के लेकिन लार्वा भागने को रोकने जाएगा.
- संदंश या एक रंग धीरे 10 जल्दी एक घर बनाया ईथरीकरण के कक्ष के अंदर तीसरे instar लार्वा जगह ब्रश का उपयोग करें.
- जगह लार्वा ढक्कन और करीब के अंदर के साथ.
नोट: अगले दो चरणों धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में आकाश एक संभावित विस्फोटक रासायनिक है और उसके धुएं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक लार्वा मानव चतनाशून्य करना.
- ईथरीकरण एक Coplin एक 10 मिलीलीटर एक ले जाने के बीकर युक्त जार के अंदर लार्वा से युक्त कक्ष रखेंकपास की गेंद ~ Diethyl ईथर के 1.5 मिलीग्राम के साथ भिगो.
- Coplin जार की टोपी के लिए 2 से 2,5 मिनट के लिए आकाश धुएं लार्वा बेनकाब पर पेंच. ध्यान दें कि अब ईथरीकरण बार प्रतिकूल लार्वा व्यवहार या अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है.
- ईथरीकरण के बाद, जार / बीकर Coplin से ईथरीकरण कक्ष निकालने के लिए, ईथर धुएं के फैलने के लिए के लिए हुड में एक कुछ सेकंड दे. अब आप हुड से प्रयोगशाला में वापस ले सकता है.
- एक जल धारा निकलना बोतल का उपयोग करने के लिए धीरे से एक छोटा सा पेट्री डिश में ईथरीकरण कक्ष से लार्वा कुल्ला.
- संदंश और Kimwipe का उपयोग करने के लिए संवेदनाहृत लार्वा सूखी और धीरे उन्हें एक 3 "x 1" काँच की खुर्दबीन स्लाइड को fastened डबल पक्षीय स्कॉच टेप की एक पट्टी पर पृष्ठीय पक्ष प्रत्यय दाग.
- एक यूवी विकिरण कक्ष के नीचे की सतह पर स्लाइड प्लेस और पराबैंगनी प्रकाश में 6 सेकंड के लिए 20 MJ / सेमी 2 तीव्रता लार्वा बेनकाब.
- स्लाइड को पानी में विसर्जित करने धीरे डबल पक्षीय scotc के लार्वा बंद फ्लोटघंटे टेप.
- संदंश या तूलिका का उपयोग करने के लिए धीरे एक 15 x 45 मिमी एक घूंट कांच संस्कृति ~ मक्खी भोजन का 1.0 मिलीग्राम जहां वे समय की एक चर (8 -24 घंटे) की अवधि के लिए 25 में ठीक हो सकता है युक्त शीशी में विकिरणित लार्वा जगह डिग्री सेल्सियस या अन्य वांछित संस्कृति तापमान फिर थर्मल nociception assays के लिए कटाई से पहले.
3. स्थानीय हीट जांच परख
हम एक व्यक्ति के लार्वा शरीर एक कस्टम निर्मित थर्मल जांच प्रो देव इंजीनियरिंग (सामग्री की तालिका देखें) द्वारा निर्मित का उपयोग क्षेत्र के लिए एक हानिकारक थर्मल उत्तेजना उद्धार. हालांकि इस जांच इष्टतम डिजाइन सुविधाओं (~ 0.07 मिमी 2 क्षेत्र के एक छोटे से धातु टिप और ठीक करने के लिए 23 से एक सेट बिंदु तापमान बनाए रखने की क्षमता डिग्री सेल्सियस से 65 डिग्री सेल्सियस) के सिद्धांत में एक छोटी सी टिप है कि गर्म किया जा सकता है के साथ किसी भी उपकरण 20 सेकंड की अवधि के लिए एक परिभाषित तापमान के लिए पर्याप्त होना चाहिए. जांच टिप dorsa पर जल्दी 3 Rd instar लार्वा ठीक प्रोत्साहित किया जाता हैपेट खंड ए 4 में एल midline (चित्र 2 देखें). इस थर्मल उत्तेजना के जवाब में, लार्वा आम तौर पर 360 डिग्री या अधिक द्वारा laterally रोलिंग की एक aversive वापसी व्यवहार एक्ज़िबिट जाएगा. यह व्यवहार एक कमरे में गैर हानिकारक तापमान धातु जांच है जो आम तौर पर उनके locomotory गतिविधि 13 में एक संक्षिप्त थामने के शामिल करने के लिए अपने हल्के स्पर्श प्रतिक्रिया से अलग है.
गर्मी की जांच परख के लिए प्रोटोकॉल:
- थर्मल जांच के पूर्व निर्धारित तापमान सेट बिंदु वांछित.
- एक तूलिका या संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे एक फ्लैट (हम आम तौर पर एक बांधने की मशीन से एक vinyl कटौती का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें) मंच है जिस पर लार्वा बाद में उत्तेजित हो जाएगा पर एक व्यक्ति लार्वा हस्तांतरण. लार्वा थर्मल जांच के साथ संपर्क होने से पहले पानी की एक पतली फिल्म द्वारा कवर किया जाना चाहिए. पानी की फिल्म लार्वा को कवर के रूप में संभव के रूप में छोटे और पूरी तरह से लार्वा को कवर किया है, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि लार्वा सूखी नहीं है जब vinyl के छू चाहिए.
- धीरे खंड ए 4 में लार्वा जांच और लार्वा (चित्र 2 देखें) की सतह के बीच एक के बारे में 45 ° कोण पर टिप के साथ प्रकाश दबाव लागू करने के खिलाफ जांच टिप दबाएँ. दबाव लार्वा की सतह पर एक मामूली खरोज कारण है और आमतौर पर हरकत को रोकने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. यदि लार्वा को स्थानांतरित करने के लिए जारी है, थोड़ा और अधिक दबाव लागू करते हैं और यह आमतौर पर बंद हो जाएगा. लार्वा से डेटा है कि देखने के या जो लगातार जांच से संपर्क के लिए क्षेत्र से बाहर स्थानांतरित करने के लिए प्रतिक्रिया या cutoff के 20 तक हासिल नहीं किया जा सकता है रिकॉर्ड नहीं.
- लार्वा उत्तेजक जारी रखें जब तक एक वापसी प्रतिक्रिया को प्रदर्शित किया जाता है या जब तक 20 सेकंड cutoff तक पहुँच जाता है, जो भी पहले होता है. लार्वा जवाब आम तौर पर पहली बार सिर और पूंछ उठाने की प्रारंभिक व्यवहार दिखाते हैं. यह आमतौर पर कम से कम 360 डिग्री रोलिंग की वापसी व्यवहार द्वारा पीछा किया जाता है. केवल 360 डिग्री की एक पूरी रोल nocifensive व्यवहार (प्रारंभिक hea के रूप में रन बनाए हैघ या पूंछ बढ़ा) नहीं है.
- एक बार वापसी व्यवहार जांच के साथ रिलीज से संपर्क शुरू की है और विलंबता या वापसी के लिए समय रिकॉर्ड है. अगर कोई वापसी व्यवहार 20 सेकंड के भीतर मनाया जाता है, तो लार्वा एक गैर प्रत्युत्तर है. responders के आगे से 2 श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है. यदि वापसी व्यवहार 5 सेकंड के भीतर दिखाया गया है, तो लार्वा एक तेजी से प्रत्युत्तर है. यदि वापसी व्यवहार 5-20 सेकंड के बीच दिखाया जाता है, तो लार्वा (Babcock, एट अल 2009. में चित्रा 1 देखें) प्रत्युत्तर धीमी गति 1 है.
4. वैश्विक उष्णता प्लेट परख
गर्मी प्लेट परख के ड्रोसोफिला लार्वा के थर्मल nociception में उपाय है जब पूरे जानवर हानिकारक थर्मल उत्तेजना के साथ सामना कर रहा है के लिए डिजाइन किया गया था. व्यक्तिगत मध्य 3 Rd instar लार्वा पानी की एक 60 x 15 मिमी पेट्री डिश पर एक 80 μl ड्रॉप में रखा जाता है योजनाबद्ध और परख सेट की तस्वीरों के लिए चित्रा 3 देखेंऊपर. पेट्री डिश तो एक ठोस हीटिंग ब्लॉक ("गर्मी थाली" के रूप में निर्दिष्ट) पर रखा गया है. बूंद पानी बढ़ जाता है के तापमान के रूप में, लार्वा पांच टकसाली व्यवहार हम सिर पिटाई, रोल, सचेतक, जब्ती, और पक्षाघात करार दिया है की एक श्रृंखला को दर्शाती है. के रूप में इन व्यवहार में जो लार्वा डूब जाता है हम यहाँ उपस्थित हम क्या इष्टतम शर्तों (95 डिग्री सेल्सियस गर्मी प्लेट, 80 μl ड्रॉप हो पाया है कुछ हद तक गर्मी प्लेट के setpoint तापमान और पानी की मात्रा के एक समारोह कर रहे हैं पानी की उन दोनों के बीच कम से कम ओवरलैप के साथ व्यवहार के 5 अवलोकन के लिए).
गर्मी प्लेट परख के लिए प्रोटोकॉल:
- फाइबर ऑप्टिक प्रकाश गाइड करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ लार्वा को देखने के लिए पर्याप्त उच्च विपरीत प्रकाश की स्थिति. एक परीक्षण अगर आवश्यक लार्वा का उपयोग करें. प्रकाश की शक्ति कम पर होना करने के लिए परीक्षण किया जा लार्वा पर परिवेश गर्मी से बचना चाहिए.
- गर्मी थाली में फ्लैट सतह के ऊपर के साथ हीटिंग ब्लॉक प्लेस और गर्मी की थाली पर जगहखुर्दबीन आधार. गर्मी प्लेट पर "उच्च" स्थिति के लिए बारी करने के लिए, तापमान के लिए लगभग 15 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं, और तदनुसार समायोजित करने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के एक सतह के तापमान को प्राप्त करने
- आसुत पानी के 80 μl उपाय है और 60 x 15 मिमी micropipettor साथ polystyrene पेट्री डिश के बीच में पानी की बूंद जगह है.
- धीरे बूंद पानी के बीच में एक स्वच्छ मध्य 3 Rd instar लार्वा जगह संदंश का प्रयोग करें. पानी की न्यूनतम मात्रा के साथ संभव लार्वा हस्तांतरण इतना है कि ड्रॉप करने के लिए गर्म किया जा रहता है के रूप में संभव के रूप में मूल के करीब 80 μl की कोशिश करो.
- धीरे ठोस हीटिंग ब्लॉक पर गर्मी की थाली पर पेट्री डिश युक्त पानी ड्रॉप और लार्वा जगह है. जल्दी से पकवान के स्थान को समायोजित तो पूरे लार्वा और पानी की हर बूंद दृश्य में हैं. चित्रा 3 और 1-6 वीडियो देखें.
- पल में टाइमर शुरू पेट्री डिश गर्मी प्लेट और रिकॉर्ड की ठोस हीटिंग ब्लॉक पर रखा गया हैप्रत्येक व्यवहार की शुरुआत के समय. अगर वांछित, व्यवहार भी वीडियो रिकार्ड किया जा सकता है प्रत्येक व्यवहार के प्रतिनिधि उदाहरण के लिए 1-5 वीडियो देखें. Leica सॉफ्टवेयर संस्करण 3.7 फिल्मों की रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था, रिकॉर्डिंग मोड "सतत" था, कैमरा संकल्प 3 मेगापिक्सेल (हम 0.63x ज़ूम के साथ जो गणना की छवि संकल्प 10 माइक्रोन / पिक्सेल का इस्तेमाल किया) और फ्रेम / 2 44.5 थे.
5. प्रतिनिधि परिणाम
स्थानीय हीट जांच परख:
थर्मल जांच के साथ संपर्क होने पर, एक लार्वा आम तौर पर अपने सिर और पूंछ उठाने का एक प्रारंभिक व्यवहार से पता चलता है. आमतौर पर सिर उठाने पहले पूंछ के उठाने के द्वारा देखा जाता है. इस प्रारंभिक व्यवहार के बाद कुछ ही सेकंड लार्वा आमतौर पर laterally रोलिंग जो हम उल्लेख के रूप में शुरू होता है "अपवर्ती वापसी व्यवहार." जो समय के बाद प्रारंभिक व्यवहार वापसी या व्यवहार दिखाया गया है तापमान या जीई के द्वारा भिन्न हो सकते हैंnetic पृष्ठभूमि. हमारे प्रारंभिक अध्ययन में हम अलग जांच तापमान सेट बिंदु पर प्रतिकूल वापसी का प्रदर्शन लार्वा का प्रतिशत मापा और पाया कि 48 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम तापमान है, जिस पर सभी लार्वा तेजी से प्रतिक्रिया (<5 ओं) था. यहाँ, हम रिपोर्ट है कि वहाँ लिए लार्वा थर्मल nociception प्रतिक्रिया (4A चित्रा) के लिए एक छत है. 100% तेजी responders के 52 डिग्री सेल्सियस के एक जांच के तापमान को मनाया जाता है हालांकि, 54 डिग्री सेल्सियस और अधिक, 90% या लार्वा की अधिक से संपर्क करने के बाद भी 20 के जवाब असफल. इन लार्वा के 20 cutoff के बाद आगे बढ़ जारी है.
1 के रूप में पहले उल्लेख किया है, प्रत्येक के तापमान पर वापसी के व्यवहार की श्रेणियों और साजिश रची जा सकता है सांख्यिकीय तुलना. यह देखते हुए कि यह एक व्यवहार की परख है वहाँ लार्वा से लार्वा के लिए और व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं के बीच कुछ परिवर्तनशीलता है. इस खाते के लिए हम आम तौर पर परीक्षण हालत प्रति 30 लार्वा के 3 सेट को मापने. WI के साधारण वर्गीकरण के अलावाthdrawal विलंबता है कि हम पहले की सूचना दी है, हम यहाँ रिपोर्ट है कि आयाम (रोल या प्रतिकूल वापसी व्यवहार में बिताए समय की संख्या) (चित्रा 4) मापा जा सकता है. हैरानी की बात है, वहाँ इनपुट तापमान और प्रतिक्रिया की मजबूती के बीच एक व्युत्क्रम संबंध हो सकता है क्योंकि कम तापमान के रोल के एक उच्च संख्या भड़काने दिखाई देते हैं (4B चित्रा) और अधिक समय प्रतिकूल वापसी में खर्च (नहीं दिखाया डेटा) होता है. यह संकेत हो सकता है कि एक हानिकारक तापमान के लिए जोखिम की अवधि मजबूती का मुख्य निर्धारक हो सकता है.
गर्मी प्लेट परख:
पांच टकसाली locomotory व्यवहार लार्वा पानी में डूब गर्मी प्लेट के हस्तांतरण पर मनाया जाता है. इन नीचे वर्णित हैं और पानी में एक unheated लार्वा के के ठेठ locomotory व्यवहार के साथ साथ वीडियो में दिखाया. औसत सुप्तावस्था जो इन व्यवहार मनाया जाता है चित्रा 5 में दिखाया जाता हैएक, के रूप में औसत पानी ड्रॉप प्रत्येक विलंबता के लिए मापा तापमान हैं. इष्टतम परख के तहत यहां की परिस्थितियों प्रस्तुत प्रत्येक अलग व्यवहार दिखा लार्वा का प्रतिशत 77 से 100% (चित्रा 5 ब) को लेकर हालांकि कभी कभी रोलिंग और सजा व्यवहार छोड़े गए हैं, ओवरलैप करते हैं, या रिवर्स क्रम में होते हैं. मनाया व्यवहार, कालानुक्रमिक क्रम में, के रूप में वर्णित कर रहे हैं और नीचे संकेत समय पर वीडियो में देखा जा सकता है:
- गर्मी के अभाव में सामान्य आंदोलन: क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला सिर आंदोलनों खोज के साथ हरकत. 6:27 से वीडियो देखें.
- सिर पीटो लार्वा कदम आगे या पार्श्व गति में जल्दी सिर. इस प्रस्ताव उनके पानी (1 वीडियो देखें) में सामान्य हरकत के लिए इसी तरह की है लेकिन अधिक झटके के साथ और लगातार होता है. 6:40 से वीडियो देखें.
- रोल: लार्वा laterally कम से कम एक पूर्ण 360 ° रोल. 6:50 से वीडियो देखें. यह भी हो सकता हैसमय की एक चर संख्या और कभी कभी अधूरा रोल शामिल है. व्यवहार हम केवल पूर्ण 360 ° रोल गिनती स्कोरिंग के प्रयोजनों के लिए. यह व्यवहार से सबसे अधिक गर्मी जांच के स्थानीय आवेदन के साथ देखा है कि समान है.
- कोड़ा: लार्वा कि सिर बहुत संक्षेप में लाने के पूंछ को करीब अग्रपश्चस्थ अक्ष के साथ तेजी से संकुचन रिलीज आंदोलनों के प्रदर्श. 7:11 से वीडियो देखें. कोड़ेबाजी अक्सर करने के लिए जल्दी उत्तराधिकार में या रोलिंग के रूप में एक ही समय में मनाया जाता है.
- जब्ती: लार्वा बाहर अग्रपश्चस्थ अक्ष के साथ फैला है और झुकने के बिना एक उच्च आवृत्ति पूरे शरीर को मिलाते हुए व्यवहार को दर्शाती है. 7:25 से वीडियो देखें.
- पक्षाघात: लार्वा आंदोलन रहता है. कुछ लार्वा में यह स्थायी है जबकि दूसरों को तो एक कम आवृत्ति धड़कन आंदोलन प्रदर्शन. 7:36 से वीडियो देखें.
ये आंकड़े बताते हैं कि पानी की बूंद और पांच चार की शुरुआत के लिए विलंबता का तापमानacteristic ड्रॉप / लार्वा पानी की वैश्विक ताप पर मनाया व्यवहार अत्यधिक सहसंबद्ध होते हैं.
आकृति 1. और लार्वा की तैयारी परख के लिए प्रयोगात्मक कदम की रूपरेखा. पहले गर्मी की जांच या गर्मी प्लेट के साथ nociception परख करने की क्रिया के लिए, किसी विशेष शेयर या आनुवंशिक पार से व्युत्पन्न लार्वा और काटा भोजन की साफ. यदि nociceptive संवेदीकरण (के रूप में में आधारभूत nociception विरोध) करने के लिए मूल्यांकन किया जा रहा है, कटाई ईथर का प्रयोग (ईथर के लिए जोखिम), बढ़ते, यूवी विकिरण, और मक्खी भोजन पर वसूली की अवधि के द्वारा पीछा किया जाता है. काटा या लार्वा बरामद तो हानिकारक गर्मी या तो (स्थानीय) जांच या गर्मी (ग्लोबल) थाली परख परीक्षण का उपयोग कर तापमान के अधीन हैं. नंबर तरीकों पाठ के वर्गों है कि (ओं) को कदम दिखाया का वर्णन करने के लिए देखें.
Figur2 ए. प्रयोगात्मक स्थानीय गर्मी की जांच परख के लिए निर्धारित किया है. गर्मी जांच थर्मल नियंत्रण इकाई है जो करने के लिए सेट और जांच के तापमान को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. जांच सीधा अग्रपश्चस्थ अक्ष के लिए आयोजित किया जाता है और 45 डिग्री के एक क्षैतिज कोण पर लार्वा को प्रोत्साहित किया. जांच से संपर्क करें विशेष रूप से पेट खंड ए 4 में किया जाता है के रूप में दिखाया गया है. उपयोगकर्ता 20 दूसरा cutoff जब तक या जब तक रोलिंग व्यवहार शुरू सौम्य दबाव के साथ इस संपर्क ऊपर बनाए रखना चाहिए. यदि तापमान हानिकारक के रूप में माना जाता है, लार्वा एक aversive वापसी व्यवहार कम से कम 360 ° रोल द्वारा विशेषता दिखाएगा. रोल की संख्या एक या एकाधिक हो सकता है (4B चित्रा) कर सकते हैं.
चित्रा 3. गर्मी प्लेट परख के लिए सेट अप प्रयोगात्मक. (ए) 60 x 15 मिमी पेट्री डिश के एक क्षैतिज देखने के कार्टून में एक मध्य 3 Rd युक्तसितारा लार्वा एक 80 μl पानी की बूंद में. (बी) के लार्वा के एक शीर्ष देखने के कार्टून के रूप में माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखी बूंद पानी के बीच में रखा. (सी) इस परख के लिए कार्य केंद्र के एक क्षैतिज दृश्य की तस्वीर. (डी) लार्वा की तस्वीर के रूप में माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा.
चित्रा 4. व्यवहार गर्मी जांच परख का उपयोग कर प्रतिक्रिया की मात्रा (ए) responders के प्रतिशत के प्लॉट प्रत्येक (तेजी से, धीमी गति से, और गैर responders) वर्ग बनाम तापमान से संबंधित. (बी) विलंबता की अपवर्ती रोल की संख्या प्रत्येक लार्वा बढ़ती नुक़सान की चार अलग परीक्षण तापमान (42 डिग्री सेल्सियस, 44 डिग्री सेल्सियस से 46 डिग्री सेल्सियस, 48 डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस, और 52 पर प्रदर्शन बनाम वापसी व्यवहार करने के लिए प्लॉट डिग्री सेल्सियस).
चित्रा 5. गर्मी प्लेट परख: लेटेंसी और तापमान बनाम behavior (ए). लेटेंसी और 95 के इष्टतम शर्तों के तहत प्रत्येक व्यवहार प्रतिक्रिया औसत बूंद पानी के तापमान डिग्री सेल्सियस (गर्म थाली की सतह के तापमान) और पानी के 80 μl ड्रॉप (n = 150). ध्यान दें कि प्रत्येक व्यवहार एक विशेष समय अंतराल के भीतर मनाया जाता है. बूंद पानी के तापमान ड्रॉप के या तो ऊपर या नीचे (n = प्रत्येक स्थान के लिए 10 बूँदें) और इन मापों में डाला गया औसत thermocouple का उपयोग कर मापा गया. (बी) लार्वा का प्रतिशत इष्टतम परख की शर्तों के तहत प्रत्येक व्यवहार प्रतिक्रिया का प्रदर्शन. ताड़ना, अधिकार, पक्षाघात और समय की लगभग 100% मनाया जाता है, जबकि रोलिंग और सजा रहे हैं 77 और समय के 80%, क्रमशः मनाया. 200 के भीतर और उच्च सेट अंक पर रोलिंग और सजा को छोड़ दिया जा सकता है या एक साथ होने पर हो सकती है कम सतह के तापमान सेट अंक जब्ती और पक्षाघात पर नहीं मनाया जाता है. पता = 150. (सी) लार्वा का प्रतिशत कि पक्षाघात व्यवहार की दीक्षा जीवित रहने के. लार्वा जब तक हो गए थे गर्मओटना पक्षाघात और तब मानक संस्कृति शर्तों को ठीक करने के लिए हटा दिया. नकली इलाज लार्वा को छोड़कर गर्मी जोखिम के लिए बराबर उपचार प्राप्त किया. इस pupae और व्यवहार्य वयस्कों के गठन के 7-13 दिन पर मात्रा निर्धारित किया गया. पता = 120.
चित्रा 6 लार्वा nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स की निष्क्रियता व्यवहार प्रतिक्रिया सुप्तावस्था बढ़ जाती है. विलंबता के संकेत जीनोटाइप के लिए प्रत्येक व्यवहार के लिए प्लॉट: 80 डब्ल्यू 1118, 109 Gal4 (2) के प्रबंध निदेशक = - Gal4 + /, यूएएस - Ork1.Δ सी + /, यूएएस - Ork1.Δ नेकां + / प्रबंध निदेशक Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, और md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC के. सभी चार कक्षाओं में multidendritic परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स के यूएएस विनियमित transgenes के प्रबंध निदेशक - Gal4 ड्राइव अभिव्यक्ति, 14 के यूएएस - Ork1.Δ सी ड्रोसोफिला खुला सही करनेवाला कश्मीर + चैनल का एक संशोधित संस्करण synaptic प्रसारण के लिए आवश्यक व्यक्त, और यू 14 के रूप में Ork1.Δ नेकां इस एक ही चैनल के एक और संशोधित संस्करण है कि synaptic प्रसारण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है व्यक्त करता है. ध्यान दें कि केवल दोनों एमडी Gal4 6 ड्राइवर और यूएएस - Ork1.Δ सी के transgenes असर लार्वा चार पांच मनाया व्यवहार (पिटाई, रोल, पक्षाघात, और जब्ती) के लिए वृद्धि हुई सुप्तावस्था बताते हैं. नोट भी है कि क्योंकि बढ़ विलंबता के लिए इन जानवरों कोड़ा रोलिंग से पहले वे रोल की. तारांकन छात्र के टी - परीक्षण द्वारा <0.05 पी अर्थ. n = से जीनोटाइप प्रति 30 लार्वा.
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Discussion
यहाँ वर्णित assays के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक थर्मल उत्तेजनाओं के लिए हानिकारक प्रतिक्रिया के लिए अलग जीनोटाइप का लार्वा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. गर्मी की जांच परख की एक मुख्य विशेषता यह है कि प्रेरणा एक ही ठिकाना पर ही दिया जाता है. यह शायद केवल चतुर्थ श्रेणी न्यूरॉन्स खंड में जांच से संपर्क के एक छोटे सबसेट है और शायद तुरंत आसन्न 11 क्षेत्रों में उन की गोलीबारी जाता है. स्थानीय उत्तेजना की वजह से, गर्मी जांच परख हानिकारक उत्तेजना है कि एक हाथ एक गर्म स्टोव से संपर्क के रूप में क्षेत्र इस तरह के एक विशेष शरीर के लिए स्थानीय है का पता लगाने के आम संवेदी अनुभव mimics. गर्मी जांच परख का एक नुकसान यह है कि यह कुछ परिवर्तनशीलता उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता की संभावना है कि तीन कारकों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है: मैं) के दबाव के साथ जो उपयोगकर्ता लार्वा की जांच लागू होता है, ii) जांच के सटीक स्थान अंतर्निहित nociceptive न्यूरॉन्स, और, iii) सटीक आंग के सापेक्ष लार्वा परजो लार्वा की जांच सतह संपर्क पर ले.
हम पहले गैर responders, धीमी गति से responders, और तेजी से responders उनकी वापसी विलंबता पर किसी दिए गए एक तापमान करने के लिए आधारित में वर्गीकृत लार्वा की मात्रात्मक रणनीति की सूचना दी. यहाँ हम भी उच्च तापमान के लार्वा जवाबदेही पर रिपोर्ट. दिलचस्प है, हम पाते हैं कि लार्वा थर्मल nociceptive प्रतिक्रियाओं के लिए एक छत है और कि यह छत 52 और 54 के बीच स्थित डिग्री सेल्सियस यह लार्वा कि एक क्षणिक रिसेप्टर (टीआरपी) क्षमता 52 से अधिक तापमान पर gating के लिए सक्षम चैनल डिग्री सेल्सियस के पास नहीं है का संकेत हो सकता है वैकल्पिक रूप से, यह सुझाव है कि सकता है कि इस्तेमाल किया न्यूरॉन्स या मांसपेशियों को आरंभ करने के लिए या बाहर ले जाने के लिए मोटर प्रतिक्रिया क्षतिग्रस्त हो गया है इससे पहले कि वे भी अपवर्ती वापसी में कार्य कर सकते हैं. हम भी वापसी के आयाम का एक अलग विश्लेषण प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए प्रतिक्रिया की मजबूती "का एक संकेतक के रूप में या तो रोल की संख्या की रिपोर्ट. एक naively,उम्मीद है कि इन मापदंडों को बढ़ाने या उत्तेजना के तापमान और समय के साथ वृद्धि होगी. हैरानी की बात है, हम पाते हैं कि यह मामला नहीं है. लार्वा हानिकारक सीमा (42 डिग्री सेल्सियस) के अंत में कम तापमान पर एक लंबे समय के लिए प्रेरित अधिक रोल दिखाने के लिए और अधिक समय खर्च रोलिंग से लार्वा उच्च तापमान (48-52 डिग्री सेल्सियस) पर जांच. यह पता चलता है कि हानिकारक तापमान खिड़की के भीतर यह मुख्य रूप से जोखिम है कि प्रतिक्रिया के आयाम निर्धारित करता है की अवधि है. चूंकि लार्वा अत्यधिक हानिकारक तापमान के उजागर करने के लिए (48-52 ° सी) के औसत पर बहुत जल्दी जवाब है, वे समय की एक लंबी लंबाई के लिए कम हानिकारक तापमान उजागर करने के लिए लार्वा के रूप में कई रोल के रूप में प्रदर्शन नहीं करते हैं. यहां बताया प्रतिक्रिया आयाम के विश्लेषण एक मात्रात्मक आयाम है जो साथ अलग जीनोटाइप या पर्यावरण जोड़तोड़ की तुलना में किया जा सकता है कहते हैं.
गर्मी प्लेट परख की एक मुख्य विशेषता है कि यह हानिकारक के लिए एक वैश्विक जोखिम शामिल हैगर्मी. जैसे, यह एक गर्म स्टोव छू से एक गर्म कड़ाही में बैठे पशु जैसा है. हालांकि यह स्पष्ट नहीं है जब एक लार्वा प्रयोगशाला इस वैश्विक जोखिम के व्यवहार प्रतिक्रियाओं स्थानीय उत्तेजना पर मनाया उन लोगों की तुलना में अधिक जटिल कर रहे हैं में जंगली में एक विश्व स्तर पर हानिकारक उत्तेजना का अनुभव हो सकता है. गर्मी प्लेट परख की ताकत, 3 अन्य लोगों द्वारा भी उल्लेख किया, यह है कि यह थोड़ा उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के बाद से लार्वा छू प्रोटोकॉल के एक घटक नहीं है. केवल पर्याप्त विचरण परिभाषित जब प्रत्येक व्यवहार के शुरू और यह दोहराया देखने / परिचित के साथ कम किया जा सकता है में किया जा रहा है. Assays के बीच एक दिलचस्प अंतर तापमान जिस पर प्रतिकूल व्यवहार शुरू की है. ये बहुत गर्मी जांच के साथ की तुलना में गर्मी प्लेट परख में कम कर रहे हैं. प्रारंभिक गर्मी जांच (सिर और पूंछ बढ़ा) के साथ संपर्क लार्वा द्वारा प्रदर्शित व्यवहार हो सकता है एक सिर गर्मी बेनी ° C से 27 ~ मनाया पिटाई की सहसंबंधीई परख. यह संभव है कि इस प्रतिक्रिया "दर्द" से अधिक "असुविधा" को दर्शाता है. हम सजा, जब्ती के सहसंबंधी, और उच्च में भी पक्षाघात नहीं देखा है (48 डिग्री सेल्सियस) गर्मी जांच परख में तापमान और यह हो सकता है कि शरीर के एक से अधिक क्षेत्र से गोलीबारी संवेदी न्यूरॉन के एक महत्वपूर्ण जन है इन व्यवहार पर लाने की जरूरत है. Nociceptive गर्मी का संकेत है कि वैश्विक उत्तेजना neuronal प्रतिक्रिया है कि अपर्याप्त हैं संक्षेप शामिल करने के लिए स्थानीय के साथ व्यवहार को गति प्रदान कर सकते हैं जांच के साथ मनाया सीमा के निचले अंत के नीचे दिलचस्प है, जब्ती और पक्षाघात व्यवहार तापमान (37 डिग्री सेल्सियस ~ 34) में मनाया जाता है गर्मी की जांच के आवेदन. कि इन तापमान वास्तव में लार्वा के लिए हानिकारक के रूप में माना जाता है अवलोकन है कि लार्वा कि पक्षाघात व्यवहार शुरू कर रहे हैं और बाद में उड़ भोजन पर ठीक करने की अनुमति दी ज्यादातर मामलों में नहीं जीवित रहने के (चित्रा 5C) द्वारा समर्थित है. आगे तर्क का समर्थन है कि गर्मी plखाया परख nociceptive प्रतिक्रियाओं को पढ़ रही है तथ्य यह है कि ज्ञात nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स में synaptic संचरण को रोकने के लिए मनाया व्यवहार (चित्रा 6) की सबसे की विलंबता बढ़ता है. अवलोकन है कि उच्च तापमान सजा व्यवहार के लिए विलंबता में कोई वृद्धि से पता चलता है कि इस व्यवहार के लिए अन्य संवेदी न्यूरॉन्स कि MD-Gal4 व्यक्त नहीं की आवश्यकता हो सकती है.
स्थानीय और वैश्विक परख में तेजी से गर्म पानी की एक बूंद में परख विसर्जन में एक छोटे से धातु जांच के गर्म टिप - संक्षेप में, दोनों assays के परिभाषित तापमान के हानिकारक थर्मल उत्तेजना के लिए एक व्यक्ति के लार्वा को उजागर शामिल है. आनुवंशिक पृष्ठभूमि और / अलग या पर्यावरण की स्थिति (उदाहरण प्लस या माइनस ऊतकों को नुकसान के लिए) को अलग करने के लिए संपर्क के ड्रोसोफिला लार्वा के व्यवहार प्रतिक्रियाओं, और अध्ययन किया जा सकता है इन assays का उपयोग मात्रा. अंत में, इन assays के परिणाम हमें बेहतर आनुवंशिक अनापत्ति प्रमाणपत्र को नियंत्रित नेटवर्क को समझने में मदद मिलेगीड्रोसोफिला और अन्य संबंधित प्रजातियों में iception.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम ईसाई Landry गर्मी जांच, डैनियल Babcock पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए गर्मी प्लेट परख, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र मक्खी शेयरों के लिए, और Galko प्रयोगशाला के सदस्यों के सुझाव के लिए लार्वा गर्मी जांच परख, शॉन स्वीनी के विकास के लिए डिजाइन के लिए धन्यवाद. यह काम MJG और अल्पसंख्यक अनुसंधान कॅरिअर (औसत) के लिए उपयोग करने के लिए एक NIH मार्क U स्टार प्रशिक्षण अनुदान (T34GM079088 ह्यूस्टन डाउनटाउन विद्वान अकादमी के विश्वविद्यालय के लिए) R01 NS069828 NIH द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
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