将生物探针使用硅烷偶联剂的硅光学生物传感器

Summary

传感器接口与复杂，生物环境，并进行有针对性的结合具有高度特异性的探针，通过表面改性传感器的高灵敏度的传感器检测。在这里，我们展示了硅光传感器使用硅烷偶联剂弥合传感器和生物环境与生物素的表面功能。

Abstract

为了与生物环境，生物传感器平台，如流行的Biacore系统（基于表面等离子体共振（SPR）技术），接口，利用各种表面改性技术，例如，可以防止表面污垢，调整表面的疏水/亲水性，适应各种电子环境，最频繁，诱导特异性对利益的目标^。1-5这些技术其他高度敏感的生物传感器的功能扩展到现实世界的复杂环境中应用，例如虽然商业化的生物传感平台，如Biacore，如血液，尿液和废水分析^。2,6-7很好地理解，标准执行等表面改性技术，这些技术还没有被翻译在一个标准化的方式向其他标签免费的生物传感平台，如回音壁模式（WGM公司）光学谐振器^。8-9 < / P>

WGM公司的光学谐振腔的有前途的技术代表进行无标签的超低浓度的物种种类繁多的检测^6,10-12灵敏度高，这些平台是其独特的几何光学的结果：WGM公司的光学谐振腔局限循环¹³一样的SPR平台在具体的，整体的共振频率的光，光场未完全密闭的感应装置，但evanesces;这个“消逝的尾巴”，可以与周围环境中的物种相互作用。这种相互作用导致改变光场的有效折射率，造成轻微的，但检测，转向装置的共振频率。由于光场的循环，它可以与环境互动多次，导致固有的信号放大，非常高的敏感性，环境中的细微变化^。2,14-15

帐篷“要在复杂环境中进行有针对性的检测，这些平台必须与探针分子（通常是一个半有约束力的对，如抗体/抗原）通过表面改性。配对虽然WGM公司光学谐振器，可以在几个几何捏造各种材料系统，是最常见的二氧化硅微球，这些球一般制作光纤，它提供了一个“干”的微可以在官能和检测实验处理结束。二氧化硅表面化学适用于附加到其表面的探针分子，然而，为平面的基板上生成的传统技术往往没有足够的这些三维结构，微球表面的任何变化（灰尘，污染，表面缺陷，不均匀涂料）可以有严重的消极后果，对他们的检测能力。在这里，我们展示了一个浅显的方法WGM公司使用硅烷偶联剂，无机表面和生物环境，弥合素连接到硅表面硅微光学谐振腔的表面官能^。8,16，虽然我们使用本报告中的传感器系统的硅微WGM公司谐振器，协议是通用的，可用于任何硅器件表面的功能化与生物素。

Protocol

1。背景

通过一个简单的三个步骤（ 图1），生物素连接到这些设备的表面。首先，我们将表面清洗干净，并填充羟基暴露要么氧等离子体或食人鱼解决方案的设备，它。第二，我们使用气相沉积重视终止与伯胺通过水解和缩合反应的羟基硅烷偶联剂。第三，我们重视通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化学表面的生物素。我们直接选择这些技术有兴趣的读者，我们以前更多有关这些技术的发展，以及我们的动机的解释工作。

这些反应的成功可以通过光镜和荧光显微镜进行评估后，伯胺此外，以及后加入生物素。虽然光米icroscopy可以用来确定是否表面功能化协议，在微球表面，甚至污染损害，荧光显微镜被用来验证生物素分子的表面覆盖的质量和均匀性，以及生物素的能力（链霉）亲和表面结合。来评估胺的覆盖范围，表面上我们用异硫氰酸荧光素（FITC标记）荧光染料，与伯胺反应形成稳定的共价硫脲联动的微。得克萨斯红一直以抗生物素​​蛋白结合的荧光染料用于标记通过生物素 - 抗生物素蛋白相互作用的表面上的生物素组。在这两种情况下，染料的选择，可以互动与表面上的官能团（或者通过受体 - 配体相互作用或共价键）。

在这里，硅烷偶联剂，其中有三个离开组和一个功能组，提供了桥梁的赌注WEEN表面无机和有机探针分子。伯胺的功能与NHS酯反应定量，以形成稳定的酰胺键。在这种情况下，我们使用生物素探针分子，其戊酸侧链已修改与NHS酯组。实际上，任何探针分子NHS酯组可以添加到表面采用以下协议。此外，这些协议是通用的，可用于任何硅器件表面功能化与生物素。

这些协议的主要挑战实际上不是化学本身，而是在硅胶微球的处理。请注意，整个协议，微球应茎，由grapsing用锋利的尖镊子轻轻处理。这使微球本身远离镊子，允许步骤之间的便捷的交通。下面的协议中的许多步骤是专为解决这一事实或。

2。微球的制备

1. 微球的构建存储住房。
   1. 使用exacto刀，切成1一块厚纸板¼×1平方米;磁带这到正常大小的玻片，并附加满足其两端，形成一卷透明胶带1节，纸板。
   2. 这将创建一个平台，微球上，可以从周围环境的提升和隔离，并防止损坏其表面。
2. 用剪刀，剪光纤从光纤线轴第3英寸。
3. 使用无聂纤维的，汽提塔，从过去的0.5英寸的切割件的纤维年底剥夺保护的聚合物涂层，只留下硅芯。清理剩余的任何一个Kimwipe的聚合物表面挫伤与甲醇轻轻擦拭与Kimwipe的的纤维。
4. 使用裸光纤切割刀，修剪剥离的结束使日只有约1毫米剥离纤维仍然对光纤末端。
5. 放入一个CO ₂激光的路径剥去光纤的一端，照顾到纤维等，其剥离的一端朝下，垂直对齐。
6. 打开CO ₂激光，剥离年底光纤表面。激光将使用2秒约3.5％的电力领域融入纤维中剥离的结束。
7. 使用镊子，认真把握的微干（非精简部分光纤）。将干到磁带辊微住房。载玻片可存储在培养皿中。这使得微球的安全存储。

3。填充表面羟基

1. 使用食人鱼解决方案：
   1. 在一个铰链盖60毫升的聚丙烯小瓶，准备一个Piranha溶液（70:30发烟H体积4：H 2 O 2（30％）），加入5毫升的双氧水，发烟硫酸11.6毫升的小瓶。注意：穿耐酸手套。
   2. 转让载玻片上，持有至少1球，小瓶。微球应该是在与液体接触，但液体不应该接触的硬纸板。调整溶液的体积，如果需要的话。
   3. 轻轻从药瓶中取出玻片，并把它插入到另一个塑料瓶含有DDI的H _{2 O}让样品在坐5分钟的解决方案。
   4. 轻轻从药瓶中取出玻片，并把它放在一个烤箱在80°C 10分钟，晾干表面。
2. 使用氧等离子体处理：
   1. 转移至少含有一个微氧离子室的玻璃幻灯片。
   2. 设置200毫托氧气压力，功率为120 W。样品的氧等离子体暴露2英里nutes。
   3. 等离子室中取出玻片。

4。将硅烷偶联剂表面

1. 置于载玻片上，至少含有一个微球，成真空干燥器在通风柜。
2. 也通风柜，打开硅烷偶联剂瓶（（APTMS）在这种情况下，aminopropyltrimethoxysilane使用），开瓶放置在干燥器。
3. 更换真空干燥器的盖子，吸气或房子真空线连接插座端口。
4. 打开房子真空或水行，撤离的真空干燥器。一旦真空密封盖子和底座之间形成，开始计时反应。这将存入到薄膜表面的硅烷偶联剂。
5. 15分钟后，关闭真空，并慢慢打开的端口，让空气进入干燥器。对于这种偶联剂，15分钟是足以形成unifo的表面上的RM单层。对于其他偶联剂，时间可能需要进行调整。

5。附加到表面的生物素

1. 约一小时前重视生物素，准备在60毫升的聚丙烯小瓶的N-hydroxylsuccinimide素（NHS-生物素）10毫米的解决方案的一个铰链盖，无水二甲基亚砜（DMSO）。
   1. 如果NHS-生物素已储存的冷，让前集结平衡至室温。
   2. 超声充分溶解在溶剂中的NHS-生物素粉1个小时的解决方案。
2. 玻片包含到另一个塑料瓶底部的微球，微球与转移，在茎顶端小瓶。
3. 转让，玻璃后面的幻灯片（这样的解决方案不触及微球，因为它被添加到小瓶），使用下来一侧的小瓶塑料吸管，NHS-生物素的解决方案的一个适当的音量。一DD足够的解决方案，包括微球表面。
4. 30分钟，在室温下放置小瓶现在包含在DMSO溶液到一个摇摆孵化器的微球和NHS-生物素（倾斜托盘），分别与5转5度的倾斜角度和速度，。
5. 轻轻地取出玻片从小瓶，轻轻地滑入另一个充满DDI的H _{2 O}小瓶像以前一样以相同的速度和倾斜角度为10分钟，倾斜托盘上放置小瓶。淡水重复此步骤两次，每次。这有助于消除多余的二甲基亚砜，从表面和消除任何物理吸附的生物素，实际上并没有移植到表面。
6. 从瓶中取出玻片，放置在烘箱在80°C下10分钟，或者直到所有水滴从表面移除。

6。胺结尾的二氧化硅荧光标记

1. 到标记后treatm的胺基与APTMS耳鼻喉科，准备在一间漆黑的房间，由溶解在1 mL无水二甲基亚砜1毫克FITC标记的FITC标记的解决方案。
2. 加入50μLFITC标记的解决方案，以1毫升0.1 M的碳酸氢钠缓冲稀释在6.1的解决方案。
3. 聚丙烯小瓶60毫升的溶液放置在一个铰链盖，轻轻地滑入胺结尾的球，重新安置在载玻片上，小瓶。
4. 小瓶放置在冰浴，让样品反应，至少4个小时在黑暗中的FITC标记的解决方案。
5. 通过两个10分钟的球碳酸钠缓冲冲洗，去除多余的荧光。像以前一样，充满了一个缓冲的铰链盖60毫升的聚丙烯小瓶，轻轻滑动到解决方案中的玻片上，该解决方案只覆盖球，而不是纸板住房照顾。用铝箔的小瓶，和以前一样，在5度5 RPM倾斜托盘放在小瓶。
6. 轻轻从小瓶中取出玻片，轻轻滑入充满了DDI的H _{2 O，}并用铝箔覆盖另一个小瓶。像以前一样以相同的速度和倾斜角度为10分钟，倾斜托盘上放置小瓶。淡水重复此步骤两次，每次。这从表面上看，有助于消除多余的染料。
7. 从小瓶轻轻地取出玻片，干在成像前10分钟在80ç烤箱。

7。荧光标记的生物素终止二氧化硅

1. 准备一个10μg/ mL的溶液，得克萨斯红抗生物素蛋白磷酸缓冲液。
2. 加入一个铰链盖的解决方案，以60毫升的聚丙烯小瓶，轻轻滑动到溶液中含有生物素终止微玻璃幻灯片，使微球只是覆盖解决方案。
3. 室温在黑暗中反应30分钟。
4. 删除多余的荧光，通过两个10分钟的冲洗s的微球在PBS缓冲。
   1. 像以前一样，充满了一个缓冲的铰链盖60毫升的聚丙烯小瓶，轻轻滑动到解决方案中的玻片上，该解决方案只覆盖球，而不是纸板住房照顾。
   2. 用铝箔的小瓶，和以前一样，在5度5 RPM倾斜托盘放在小瓶。
5. 轻轻从小瓶中取出玻片，轻轻滑入充满了DDI的H _{2 O，}并用铝箔覆盖另一个小瓶。像以前一样以相同的速度和倾斜角度为10分钟，倾斜托盘上放置小瓶。淡水重复此步骤两次，每次。这从表面上看，有助于消除多余的染料。
6. 从小瓶轻轻地取出玻片，干在烤箱在80°Ç成像前10分钟。

8。代表结果

正确功能微球s可以通过光学和荧光显微镜鉴定。如果做正确的表面功能，它应该导致生物素分子在表面上的一致密集覆盖，表面应保持功能化后的缺陷和无污染，以维持他们的高灵敏度检测实验。光学显微镜可以用来探测后者，而荧光显微镜可以探测表面覆盖的质量和均匀。在图2中，我们显示正确的功能微球的例子。这些图像表明，有因官能（ 图2a）没有表面损坏或污染，微显示表面上均匀一致的覆盖面，要么胺组（ 图2b）或生物素组（ 图2c） 。

如果球都没有被正确的功能，光学微图像无线会出现表面污染，结块或非均匀覆盖，并在表面的明显缺陷，如表面裂纹，（ 图3）。在这里，我们看到了一个常见的​​例子表面污染，造成表面上聚集试剂。

图1 3步附加硅胶微球表面探针分子的反应计划。 点击这里查看大图 。

图2。二氧化硅微球。一）硅微光学显微镜通过接触氧等离子体填充羟基二）填充二氧化硅微球的荧光显微镜与伯胺，用FITC染料标记; C）荧光显微镜硅公里crosphere填充用生物素和德克萨斯红抗生物素蛋白共轭标记。从Soteropulos许可转载，CE，亨特，香港与阿玛尼，使用回音壁模式微腔的结合动力学测定;物理学。 LETT。99 103703-103703（2011年）。版权所有2011年，美国物理研究所^17。

图3。不当功能领域的光学显微镜。在这里，你可以看到右上角的表面上的灰尘，以及污染扩大表面。此外，右侧显示的光学微表面上的小草皮。

Discussion

在协议中所述，我们创建了一个平台，住房，运输整个功能化过程中的硅胶微球其茎。这房屋平台创建作为解决表面污染和破坏，导致微接触的整个官能过程中使用的各种容器的墙壁。我们意识到，不断地安装和拆卸功能化过程中个人微不同的容器中出现的主要困难。这是难以避免的打击对象刷牙微用镊子移动时，每个单独持有到茎。稳定在载玻片上的每一个微球的位置，我们可以简单地在不同的容器，​​并指出移动的微处理的玻片，而不是微干。这样，我们能够许多这些开发功能化冰在同一时间，和我们消除污染和表面处理不当造成的损坏，导致〜90％的成功率，创造完好，官能微。

由于在协议中表示，我们探讨了两种方法，其中以羟基化的二氧化硅微球。 Piranha溶液通常用于此，虽然它可以是费时，需要湿化学。与微工作时，我们注意到通过羟基氧等离子体处理的优越性。氧等离子体处理需要与液体的解决方案，不干燥，无硅胶微球的处理没有接触。此外，它是一个更快的填充表面羟基的过程。然而，我们认识到，并非每一个研究小组，将有机会获得氧等离子体设备，并因此可能需要使用piranha的解决方案，以形成必要的羟基功能。或者使用会导致羟基形成表面。

表面功能化过程中的污染防治是一个重大的问题，但它可以通过认真遵守协议的最小化。污染最可能的原因是功能化过程中，处理不当，以及不当或不彻底清洗表面后，每个反应步骤。这是特别是在第一步反应的情况下，表面羟基填充。如果食人鱼解决方案选择了这种方法，必须小心从表面彻底清除任何硫酸，并彻底干燥的微球，表面是现在非常亲水性，并从冲洗水，攀缘在表面。如果保持表面上的硫酸，微成为“粘”，并从实验室环境中的灰尘，表面上更容易收集。此外，在表面上的水滴会导致硅烷偶联剂聚集在面积的扫管笏ER飞沫传播，形成一个聚合的硅胶水珠，这是聚集在荧光显微镜。如果确实发生表面凝结，它可以防止微球被用于检测实验，因为在大型设备的灵敏度下降。通常情况下，用氧等离子体处理时，表面结块，以及污染降到最低。然而，并不是每个实验室都有访问该设备，因此使用Piranha溶液可能是必要的。

最后，我们发现有必要超声NHS-生物素的解决方案，使用前充分溶解在DMSO NHS-生物素。 NHS-生物素时跳过了这一步，将存放到表面通过物理吸附，共价结合，而不是表面的大团块。这些大团块是极其困难的，在洗涤步骤中删除，但可以通过适当的分散阻止在最初的解散。通常是一小时即可达到这一目的;然而，如果这些程序扩展到其他探针分子修饰与NHS酯组，我们建议的解决方案通过动态光散射评估，以确保充分溶解。

在这里详细的协议，表示在平面硅表面化学三维设备，表面覆盖的质量和设备表面同样重要的是设备的最终使用的翻译一步。使用这些协议时，全功能的微探针分子呈均匀致密的覆盖面，表面上没有污染或聚集。这种表面均匀覆盖，使这些设备用于检测实验时，为维护高灵敏度。使用硅烷偶联剂作为无机基质和生物探针分子之间的桥梁是简单明了，并且可以使用，特别是充分理解（和非常C，ommon）NHS酯化学，光学传感器的表面填充不同类型的探针分子。