सिलिका ऑप्टिकल Biosensors silane युग्मन एजेंटों का उपयोग करने के लिए जैविक जांच संलग्न

Summary

Biosensors जटिल, जैविक वातावरण के साथ इंटरफेस और अत्यधिक विशिष्ट सतह के संशोधन के माध्यम से सेंसर से जुड़ी जांच के साथ अत्यधिक संवेदनशील सेंसर के संयोजन द्वारा लक्षित पता लगाने के प्रदर्शन. यहाँ, हम बायोटिन साथ सिलिका ऑप्टिकल सेंसर silane युग्मन एजेंट का उपयोग करने के लिए सेंसर और जैविक पर्यावरण को पाटने की सतह functionalization प्रदर्शित करता है.

Protocol

1. पृष्ठभूमि

बायोटिन एक सरल, तीन कदम प्रक्रिया (चित्रा 1) के माध्यम से इन उपकरणों की सतह से जुड़ा हुआ है. सबसे पहले, हम सतह को साफ और हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ या तो ऑक्सीजन प्लाज्मा या पिरान्हा समाधान के लिए उपकरणों को उजागर करके आबाद. दूसरा, हम वाष्प जमाव का उपयोग करने के लिए silane युग्मन एजेंट hydrolysis और संक्षेपण प्रतिक्रिया के माध्यम से हाइड्रॉक्सिल समूहों के लिए एक प्राथमिक amine के साथ समाप्त कर देते हैं. तीसरा, हम एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर रसायन शास्त्र के माध्यम से सतह बायोटिन देते हैं. हम इन तकनीकों के विकास के बारे में अधिक जानकारी, साथ ही हमारी प्रेरणा का एक विवरण के लिए हमारे पिछले काम करने के लिए इन तकनीकों को चुनने के लिए दिलचस्पी पाठक प्रत्यक्ष ⁸

इन प्रतिक्रियाओं की सफलता प्राथमिक amine की के बाद इसके अलावा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति के माध्यम से मूल्यांकन किया बायोटिन के अलावा के बाद के रूप में अच्छी तरह के रूप में कर सकते हैं. जबकि ऑप्टिकल हूँicroscopy निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर सतह functionalization प्रोटोकॉल microsphere सतह, या भी संदूषण के लिए नुकसान के परिणामस्वरूप, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और बायोटिन अणु की सतह कवरेज की गुणवत्ता में एकरूपता की पुष्टि के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बायोटिन की क्षमता पर सतह avidin (strept) के साथ बाँध के लिए. सतह पर amines के कवरेज का मूल्यांकन करने के लिए, हम fluorescein (FITC) आइसोथियोसाइनेट फ्लोरोसेंट रंजक, जो प्राथमिक amines के साथ प्रतिक्रिया करता है microsphere करने के लिए स्थिर, सहसंयोजक Thiourea उठाना के रूप में इस्तेमाल किया. टेक्सास लाल फ्लोरोसेंट रंजक कि avidin संयुग्मित किया गया है बायोटिन - avidin बातचीत के माध्यम से सतह पर बायोटिन समूहों लेबल के लिए प्रयोग किया जाता है. दोनों ही मामलों में, रंग चुना गया था कि या तो रिसेप्टर ligand बातचीत या सहसंयोजक संबंध के माध्यम से सतह पर कार्य समूहों के साथ बातचीत कर सकते हैं.

यहाँ, silane युग्मन एजेंट, जो तीन छोड़ने समूहों के और एक कार्यात्मक समूह पुल शर्त प्रदान करता हैअकार्बनिक सतह और जैविक जांच अणु समझना. प्राथमिक amine कार्यक्षमता में एनएचएस एस्टर के साथ मात्रात्मक प्रतिक्रिया करने के लिए स्थिर एमाइड बांड फार्म. इस मामले में, हम एक बायोटिन जांच अणु जिसका मुल का पक्ष श्रृंखला एक एनएचएस एस्टर समूह के साथ संशोधित किया गया है का उपयोग करें. वास्तविक है, जो करने के लिए किसी भी जांच के अणु एक एनएचएस एस्टर समूह निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सतह के लिए जोड़ा जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इन प्रोटोकॉल सामान्य हैं, और बायोटिन के साथ किसी भी सिलिका युक्ति सतह functionalize इस्तेमाल किया जा सकता है.

इन प्रोटोकॉल के साथ प्राथमिक चुनौती वास्तव में रसायन शास्त्र में ही नहीं है, लेकिन सिलिका microspheres की हैंडलिंग में है, बल्कि. कृपया नोट करें कि प्रोटोकॉल भर की microspheres उनके उपजी तेज इत्तला दे दी चिमटी के साथ को हल्के grapsing द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए. यह चिमटी अच्छी तरह से खुद microspheres से दूर रहता है, और कदम के बीच आसान परिवहन के लिए अनुमति देता है. नीचे प्रोटोकॉल कई चरणों में विशेष रूप से इस तथ्य का पता करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैंया.

2. Microsphere निर्माण

1. Microspheres के लिए भंडारण आवास निर्माण.
   1. एक exacto चाकू का प्रयोग, में 1 वर्ग में एक्स 1 में गत्ते की मोटी टुकड़ा में एक ¼ में कटौती, टेप नियमित रूप से आकार के एक गिलास स्लाइड पर, और स्कॉच टेप के अनुभाग में 1 इसके समाप्त होता है के लिए एक रोल के रूप में बैठक के साथ संलग्न , गत्ते करने के लिए.
   2. यह एक मंच है जिस पर microsphere को ऊपर उठाया जा सकता है और आसपास के वातावरण से अलग बनाता है, और उनकी सतह को नुकसान से बचाता है.
2. कैंची का प्रयोग, ऑप्टिकल फाइबर की एक स्पूल से एक ऑप्टिकल फाइबर की 3 इंच अनुभाग में कटौती.
3. एक नहीं, Nik फाइबर खाल उधेड़नेवाला का उपयोग करना, फाइबर की कटौती टुकड़ा के अंत के अंतिम 0.5 इंच से सुरक्षा polymeric कोटिंग पट्टी, बस सिलिका कोर छोड़ने. एक Kimwipe साथ किसी भी शेष बहुलक की सतह को साफ धीरे से Kimwipe साथ फाइबर पोंछते द्वारा मेथनॉल साथ घटा.
4. एक नंगे फाइबर क्लीवर का उपयोग करना, छीन अंत इतना वें ट्रिमकेवल 1 के बारे में छीन फाइबर की मिलीमीटर फाइबर के अंत पर रहता है.
5. सीओ ₂ लेजर के पथ में ऑप्टिकल फाइबर की छीन अंत प्लेस, खड़ी ऐसी है कि इसके छीन अंत नीचे का सामना करना पड़ रहा है फाइबर संरेखित ख्याल रख रही है.
6. सीओ ₂ लेजर पर बारी, और ऑप्टिकल फाइबर की छीन अंत की सतह करने के लिए प्रत्यक्ष. लेजर 2 सेकंड में लगभग 3.5% की शक्ति का उपयोग क्षेत्र में फाइबर की छीन अंत पिघल जाएगा.
7. चिमटी का उपयोग कर, सावधानी से समझ है microsphere के स्टेम (ऑप्टिकल फाइबर की गैर छीन भाग). Microsphere आवास पर टेप रोल करने के लिए स्टेम संलग्न. गिलास स्लाइड ही एक पेट्री डिश में संग्रहीत किया जा सकता है. इस microsphere के सुरक्षित भंडारण के लिए अनुमति देता है.

3. हाइड्रॉक्सिल समूह के साथ भूतल populating के

1. पिरान्हा समाधान का उपयोग करना:
   1. 60 मिलीग्राम एक hinged टोपी के साथ polypropylene शीशी में, एक पिरान्हा समाधान तैयार (एच धूमायमान मात्रा से 70:30 4: 2 शीशी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 5 मिलीलीटर जोड़ने, सल्फ्यूरिक एसिड नाराज 11.6 एमएल के बाद से एच ओ ₂ (30% wt)). चेतावनी: एसिड प्रतिरोधी दस्ताने पहनते हैं.
   2. कांच स्लाइड स्थानांतरण, शीशी के लिए कम से कम 1 microsphere पकड़े. microsphere तरल के साथ संपर्क में होना चाहिए, लेकिन तरल गत्ता नहीं छूना चाहिए. अगर जरूरत समाधान की मात्रा समायोजित करें.
   3. धीरे शीशी से गिलास स्लाइड हटाने, और यह एक और प्लास्टिक युक्त शीशी DDI एच ₂ ओ में सम्मिलित नमूनों समाधान में 5 मिनट के लिए बैठते हैं.
   4. धीरे शीशी से गिलास स्लाइड को हटाने, और यह एक ओवन 80 डिग्री सी 10 मिनट के लिए सतह शुष्क करने की जगह है.
2. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार का उपयोग:
   1. गिलास स्लाइड ऑक्सीजन प्लाज्मा चैम्बर में कम से कम एक microsphere युक्त स्थानांतरण.
   2. ऑक्सीजन 200 mTorr के लिए दबाव, और बिजली के लिए 120 डब्ल्यू 2 मील के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा नमूना बेनकाब सेटnutes.
   3. प्लाज्मा चैम्बर से गिलास स्लाइड निकालें.

4. भूतल silane युग्मन एजेंटों संलग्न

1. गिलास स्लाइड, एक धूआं हुड में एक निर्वात desiccator में कम से कम एक microsphere युक्त रखें.
2. धूआं हुड में भी, silane युग्मन एजेंट बोतल (इस मामले में है, aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) का इस्तेमाल किया गया था) खोलने के लिए, और desiccator में खोला बोतल जगह है.
3. निर्वात desiccator पर ढक्कन बदलें, और एक चूषित्र या घर निर्वात रेखा के आउटलेट बंदरगाह देते हैं.
4. घर निर्वात या पानी की लाइन पर बारी, और निर्वात desiccator खाली. एक बार एक वैक्यूम मुहर ढक्कन और बेस के बीच का गठन किया है, प्रतिक्रिया समय शुरू करते हैं. यह एक पतली फिल्म के रूप में सतह पर silane युग्मन एजेंट जमा करेगा.
5. 15 मिनट के बाद, निर्वात बारी, और धीरे धीरे बंदरगाह खोलने के desiccator में हवा जाने. इस युग्मन एजेंट के लिए, 15 मिनट unifo फार्म करने के लिए पर्याप्त हैrm monolayer की सतह पर. अन्य युग्मन एजेंट के लिए, समय को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.

5. भूतल के लिए बायोटिन संलग्न

1. बायोटिन संलग्न करने से पहले लगभग एक घंटे निर्जल dimethylsulfoxide (DMSO के) में एक polypropylene के 60 एमएल की शीशी में एक hinged टोपी के साथ एन hydroxylsuccinimide बायोटिन (एनएचएस बायोटिन) एक 10 मिमी समाधान तैयार.
   1. अगर एनएचएस बायोटिन ठंड संग्रहीत किया गया है, यह इसे बढ़ा बाहर से पहले कमरे के तापमान को संतुलित करना करने के लिए अनुमति देते हैं.
   2. 1 घंटे के लिए समाधान के लिए पूरी तरह से विलायक में एन एच एस-बायोटिन पाउडर भंग Sonicate.
2. एक और प्लास्टिक शीशी में तल पर microspheres के साथ microsphere, जिसमें कांच स्लाइड स्थानांतरण, और शीशी के शीर्ष पर उपजी है.
3. स्थानांतरण, शीशी के पक्ष नीचे गिलास स्लाइड (तो समाधान microsphere छू नहीं के रूप में यह शीशी जोड़ा जा रहा है करता है) के पीछे एक प्लास्टिक pipet, एन एच एस-बायोटिन समाधान के एक उचित मात्रा का उपयोग करते हुए. एकडीडी पर्याप्त समाधान microsphere सतह को कवर करने के लिए.
4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अब DMSO के समाधान में एक कमाल की इनक्यूबेटर पर microspheres और एन एच एस-बायोटिन युक्त शीशियों प्लेस (झुकाव ट्रे), गति और rpm के 5 और 5 डिग्री के झुकाव का कोण के साथ क्रमशः,.
5. धीरे शीशी से गिलास स्लाइड को हटाने, और धीरे यह एक और DDI एच ₂ ओ के साथ भरी शीशी में स्लाइड शीशी एक ही गति और पहले के रूप में झुकाव कोण पर एक और 10 मिनट के लिए झुकाव ट्रे पर रखें. इस कदम को दो बार ताजे पानी के साथ हर बार दोहराएँ. यह सतह से अतिरिक्त DMSO के हटाने में मदद करता है, और किसी भी शारीरिक रूप से adsorbed के बायोटिन है कि वास्तव में सतह के लिए भ्रष्टाचार नहीं किया हटा.
6. शीशी से गिलास स्लाइड निकालें, और यह 80 पर एक ओवन डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट, या जब तक पानी की बूँदों सतह से हटा रहे हैं में जगह है.

6. Amine समाप्त सिलिका की फ्लोरोसेंट लेबलिंग

1. अमाइन उपचार के बाद मौजूद समूहों लेबलसाथ ईएनटी APTMS, एक अंधेरे कमरे में 1 एमएल निर्जल DMSO के 1 मिलीग्राम FITC भंग द्वारा FITC समाधान तैयार.
2. 6.1 में 0.1 एम सोडियम बिकारबोनिट बफर के 1 एमएल FITC समाधान के 50 μL जोड़कर समाधान जलमिश्रित.
3. एक polypropylene के 60 एमएल की शीशी में एक hinged टोपी के साथ समाधान, प्लेस और धीरे से शीशी में amine समाप्त microspheres, गिलास स्लाइड पर फिर से रखे, स्लाइड.
4. एक बर्फ स्नान में शीशी प्लेस, और दो नमूना अंधेरे में 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए FITC समाधान के साथ प्रतिक्रिया.
5. दो, सोडियम कार्बोनेट बफर में 10 मिनट rinses microspheres के माध्यम से अतिरिक्त fluorophore निकालें. जैसा कि पहले, बफर के साथ एक hinged टोपी के साथ एक 60 एमएल polypropylene के शीशी भरने, और धीरे समाधान में कांच स्लाइड स्लाइड, ख्याल रख रही है कि समाधान केवल, microsphere, और नहीं गत्ता आवास शामिल हैं. शीशी एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर, और पहले के रूप में एक झुकाव 5 डिग्री और 5 आरपीएम पर सेट ट्रे पर शीशी, जगह.
6. धीरे शीशी से गिलास स्लाइड हटाने के लिए, और धीरे से एक और DDI एच ₂ हे से भरा है और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर शीशी में स्लाइड. शीशी एक ही गति और पहले के रूप में झुकाव कोण पर एक और 10 मिनट के लिए झुकाव ट्रे पर रखें. इस कदम को दो बार ताजे पानी के साथ हर बार दोहराएँ. यह सतह से अतिरिक्त डाई हटाने में मदद करता है.
7. धीरे शीशी से गिलास स्लाइड को हटाने, और एक इमेजिंग से पहले 10 मिनट के लिए 80 सी पर सेट ओवन में सूखी.

7. बायोटिन समाप्त सिलिका के फ्लोरोसेंट लेबलिंग

1. Avidin फॉस्फेट में टेक्सास लाल के समाधान 10 μg / एमएल तैयार खारा बफर.
2. एक hinged टोपी के साथ एक 60 एमएल polypropylene के शीशी का हल जोड़ें, और धीरे समाधान में एक बायोटिन समाप्त microsphere युक्त गिलास स्लाइड स्लाइड, ताकि microsphere समाधान द्वारा कवर किया जाता है.
3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया.
4. दो के माध्यम से अतिरिक्त fluorophore निकालें, 10 मिनट कुल्लापीबीएस बफर में microspheres की है.
   1. जैसा कि पहले, बफर के साथ एक hinged टोपी के साथ एक 60 एमएल polypropylene के शीशी भरने, और धीरे समाधान में कांच स्लाइड स्लाइड, ख्याल रख रही है कि समाधान केवल, microsphere, और नहीं गत्ता आवास शामिल हैं.
   2. शीशी एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर, और पहले के रूप में एक झुकाव 5 डिग्री और 5 आरपीएम पर सेट ट्रे पर शीशी, जगह.
5. धीरे शीशी से गिलास स्लाइड हटाने के लिए, और धीरे से एक और DDI एच ₂ हे से भरा है और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर शीशी में स्लाइड. शीशी एक ही गति और पहले के रूप में झुकाव कोण पर एक और 10 मिनट के लिए झुकाव ट्रे पर रखें. इस कदम को दो बार ताजे पानी के साथ हर बार दोहराएँ. यह सतह से अतिरिक्त डाई हटाने में मदद करता है.
6. गिलास स्लाइड धीरे शीशी से निकालने के लिए, और एक 80 पर सेट इमेजिंग से पहले 10 मिनट के लिए ओवन ° सी में सूखा.

8. प्रतिनिधि परिणाम

सही ढंग से है functionalized microsphereएस ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति के माध्यम से पहचाना जा सकता है. यदि सतह functionalization सही ढंग से किया है, यह सतह पर बायोटिन अणुओं की एक समान रूप से घने कवरेज में परिणाम चाहिए और सतह दोष और संदूषक मुक्त functionalization के बाद रहने के क्रम में पता लगाने के प्रयोगों के दौरान उनके उच्च संवेदनशीलता को बनाए रखने चाहिए. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के बाद जांच, जबकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और सतह के कवरेज की गुणवत्ता और एकरूपता की जांच कर सकते हैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 2 में, हम सही ढंग से है functionalized microspheres के उदाहरणों से पता चलता है. इन छवियों को दिखाने के लिए कि वहाँ कोई सतह क्षति या functionalization छवि (2a) के कारण संदूषण है, और है कि microspheres सतह पर एक समान, या तो amine समूह (छवि 2b) या बायोटिन समूहों के (छवि 2c) के लगातार कवरेज दिखा .

यदि microspheres के सही ढंग से नहीं किया गया है functionalized है, ऑप्टिकल microsphere वाई छवियोंसतह संदूषण, clumping या गैर वर्दी कवरेज, और सतह में स्पष्ट सतह दरारें तरह, दोष (चित्रा 3) प्रदर्शन करेंगे. यहाँ, हम सतह संदूषण का एक आम उदाहरण है, जिसके परिणामस्वरूप अभिकर्मकों की सतह पर clumping से देखते हैं.

चित्रा 1 3 कदम सिलिका microspheres की सतह के लिए जांच के अणुओं संलग्न करने के लिए प्रतिक्रिया योजना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2 सिलिका microspheres. ) सिलिका microsphere की ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ ऑक्सीजन प्लाज्मा करने के लिए जोखिम के माध्यम से हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ आबादी, ख) सिलिका microsphere की प्रतिदीप्त माइक्रोग्राफ प्राथमिक amines के साथ आबादी और FITC डाई के साथ लेबल, ग) सिलिका मील प्रतिदीप्त माइक्रोग्राफcrosphere बायोटिन के साथ आबादी और टेक्सास लाल avidin संयुग्म के साथ लेबल. Soteropulos से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित, CE, हंट, एच, और अरमानी, बाध्यकारी फुसफुसा गैलरी मोड microcavities का उपयोग कैनेटीक्स का निर्धारण Appl. मानसिक. लेटिष. 99, 103703-103703 (2011). कॉपीराइट 2011, अमेरिकी संस्थान भौतिकी के ^17.

चित्रा 3 अनुचित तरीके से है functionalized क्षेत्र की ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ. यहाँ, आप शीर्ष सही सतह पर धूल देखते हैं, साथ ही प्रदूषण बंद कर सकते हैं सतह का विस्तार. इसके अतिरिक्त, ऑप्टिकल microsphere की दाईं ओर की सतह पर एक छोटा सा divot से पता चलता है.

Discussion

प्रोटोकॉल में वर्णित है, हम एक आवास मंच बनाया है जिसके द्वारा functionalization प्रक्रिया के दौरान उनके उपजी सिलिका microspheres के परिवहन के लिए. इस आवास मंच सतह संदूषण और क्षति कि microsphere विभिन्न functionalization प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया कंटेनर की दीवारों के साथ संपर्क में आने से हुई एक समाधान के रूप में बनाया गया था. हम मुख्य लगातार संलग्न और detaching functionalization प्रक्रिया के दौरान व्यक्ति की microspheres अलग कंटेनरों से पैदा हुई कठिनाई का एहसास हुआ. यह मुश्किल था जब चिमटी के साथ प्रत्येक व्यक्तिगत उपजी पर पकड़े द्वारा एक वस्तु के खिलाफ brushing के microsphere से बचने. गिलास स्लाइड पर प्रत्येक microsphere की स्थिति स्थिर है, हम करने के लिए बस में और बाहर अलग कंटेनरों के गिलास स्लाइड से निपटने microspheres की एक संख्या को स्थानांतरित करने में सक्षम थे, microsphere स्टेम नहीं और. इस तरह, हम इन देव के कई functionalize करने में सक्षम थेएक ही समय पर ices, और हम प्रदूषण और सतह अनुचित हैंडलिंग के कारण नुकसान का सफाया, एक ~ 90% undamaged, functionalized microspheres बनाने की सफलता की दर में जिसके परिणामस्वरूप.

प्रोटोकॉल में कहा गया है, हम दो तरीकों का पता लगाया है जिसके द्वारा सिलिका microspheres के hydroxylate. जबकि पिरान्हा समाधान आमतौर पर इस के लिए प्रयोग किया जाता है, यह समय लेने वाली हो, और गीला रसायन विज्ञान की आवश्यकता है. जब microspheres के साथ काम कर रहे, हम ऑक्सीजन प्लाज्मा इलाज के माध्यम से hydroxylation की श्रेष्ठता का उल्लेख किया. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार तरल समाधान, नहीं, सुखाने, और सिलिका microspheres की कोई हैंडलिंग के साथ कोई संपर्क की आवश्यकता है. इसके अतिरिक्त, यह एक बहुत तेजी से हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ सतह को पॉप्युलेट करने के लिए प्रक्रिया है. हालांकि, हम समझते हैं कि नहीं हर अनुसंधान समूह ऑक्सीजन प्लाज्मा उपकरणों के लिए उपयोग किया है, और इसलिए पिरान्हा समाधान का उपयोग करने के लिए अपेक्षित हाइड्रॉक्सिल कार्यक्षमता के रूप में की आवश्यकता हो सकती है. या तो का उपयोग हाइड्रॉक्सिल समूहों के गठन में परिणाम होगासतह.

सतह functionalization के दौरान संक्रमण की रोकथाम के एक प्रमुख मुद्दा है, लेकिन यह प्रोटोकॉल के लिए सावधान पालन द्वारा कम किया जा सकता है. संदूषण की सबसे अधिक संभावना कारण functionalization दौरान गरीब हैंडलिंग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हर कदम की प्रतिक्रिया के बाद सतह के अनुचित या गैर पूरी तरह से धोने हैं. यह पहली प्रतिक्रिया कदम है, जहां सतह हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ आबादी है के दौरान विशेष रूप से मामला है. यदि इस विधि पिरान्हा समाधान के लिए चुना जाता है, देखभाल करने के लिए सतह से अच्छी तरह से किसी भी सल्फ्यूरिक एसिड को हटाने, और अच्छी तरह से microsphere सूखी, के रूप में सतह अब बहुत हाइड्रोफिलिक, पानी और rinses से सतह को पकड़ लेता है लिया जाना चाहिए. यदि सल्फ्यूरिक एसिड की सतह पर रहता है, microsphere "" चिपचिपा और प्रयोगशाला वातावरण से धूल हो जाता है और अधिक आसानी से सतह पर एकत्र. इसके अतिरिक्त, सतह पर पानी की बूंदों silane युग्मन एजेंट कारण वाट के क्षेत्र में एकत्रएर बूंदों, एक polymeric सिलिका ग्लोब, जो फ्लोरोसेंट micrographs में कणों का जैसे जीवाणुओं का पिण्ड के रूप में एकत्रित हो जाना के रूप में देखा जाता है बनाने. यदि सतह clumping को होती है, यह पता लगाने के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा रहा से युक्ति की संवेदनशीलता में एक बड़ी गिरावट की वजह से microsphere, रोकता है. आमतौर पर, जब ऑक्सीजन प्लाज्मा इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है, सतह clumping, के साथ ही प्रदूषण, कम से कम है. हालांकि, इस उपकरण का उपयोग हर प्रयोगशाला नहीं है, तो पिरान्हा समाधान का उपयोग कर एक आवश्यकता हो सकती है.

अंत में, हमने पाया है कि यह आवश्यक था एन एच एस-बायोटिन समाधान पूर्व sonicate उपयोग करने के लिए पूरी तरह से DMSO में एन एच एस बायोटिन भंग. जब इस कदम को छोड़ दिया गया था, एन एच एस बायोटिन शारीरिक सोखना, बजाय covalently सतह के लिए बाध्य के माध्यम से बड़े clumps में सतह पर जमा होगा. ये बड़े clumps वाशिंग चरणों के दौरान निकालना बेहद मुश्किल है, लेकिन उचित प्रसार द्वारा प्रारंभिक विघटन के दौरान रोका जा सकता है. एक घंटे के आम तौर पर इस उद्देश्य के लिए पर्याप्त है;हालांकि, अगर इन प्रक्रियाओं अन्य जांच एनएचएस एस्टर समूहों के साथ संशोधित अणुओं को बढ़ा रहे हैं, हम गतिशील प्रकाश बिखरने के माध्यम से समाधान का मूल्यांकन करने के लिए पूर्ण विघटन को सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं.

यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल तलीय सिलिका तीन आयामी उपकरणों, जहां सतह कवरेज और युक्ति सतह की गुणवत्ता उपकरणों के अंतिम उपयोग के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण हैं सतह chemistries के अनुवाद में एक कदम आगे का प्रतिनिधित्व करते हैं. जब इन प्रोटोकॉल उपयोग किया जाता है, पूरी तरह से है functionalized microspheres या सतह पर संदूषण कणों का जैसे जीवाणुओं का पिण्ड के रूप में एकत्रित हो जाना के साथ जांच अणु के समान घने कवरेज दिखाया. यह वर्दी सतह कवरेज उच्च संवेदनशीलता के रखरखाव के लिए अनुमति देता है जब इन उपकरणों का पता लगाने के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है. अकार्बनिक सब्सट्रेट और जैविक जांच अणु के बीच एक सेतु के रूप में silane युग्मन एजेंट का उपयोग सरल और सीधा है, और, विशेष रूप से अच्छी तरह से समझ (और बहुत सी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैommon) एनएचएस एस्टर रसायन शास्त्र, विभिन्न प्रकार की जांच के अणुओं के साथ ऑप्टिकल biosensor सतहों आबाद.